哺乳動物

PBS低滲緩沖液低鹽緩沖液透析緩沖液

轉(zhuǎn)子離心機電導計透析膜勻漿機離心管

1a.  收集轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)的細胞：將濃度為5~10×10⁸細胞/l 的培養(yǎng)液用1 L 的塑料瓶1 850 g 離心20 min，將細胞收入50 ml 錐形離心管中（每管收2~3 L 培養(yǎng)液中的細胞）。進行步驟2。

1b.  收集單層培養(yǎng)的細胞：單層細胞長滿后去掉培養(yǎng)液。用PBS洗1次。將細胞刮入新鮮PBS液里，倒進錐形離心管中。進行步驟2。

2.  1 850 g 離心10 min。

3a.  轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)細胞：測量壓緊后細胞的體積。將細胞重懸于約5倍于其pcv的PBS液中，1 850 g 離心10 min。進行步驟4。

3b.  單層培養(yǎng)細胞：測量pcv，進行步驟4。

4.  快速地將沉淀的細胞重懸于5倍體積的低滲緩沖液中，1 850 g 離心10 min。將細胞沉淀重懸于3倍于原pcv的低滲緩沖液中，放置在冰上10 min，讓細胞腫脹。

5.  在Dounce氏玻璃勻漿器中用B號研杵緩饅上下抽提10次以上。用臺盼藍染色排斥法在顯微鏡下檢査細胞裂解滑況（應大于80%~90%）。

6.  3 300 g 離心15 min，保留上清用來制備S-100細胞質(zhì)提取物。

7.  測量第6步離心沉淀的壓緊后的細胞核體積。用1/2 pnv體積的低鹽緩沖液重懸細胞核（必要時用Dounce氏玻璃勻漿器勻漿一次）。

8.  在輕輕攪拌的同時，逐滴加入1/2 pnv體積的高鹽緩沖液。終濃度應約為300 mmol/l。

9.  25 000 g 離心30 min，測量核提取物的電導率（用上請，見步驟10）。

10.  將核提取物加入透析管中，在50倍體積的透析液中進行透析，直到提取物的電導率和透析液一致為止（當提取物的KCl濃度達到100 mmol/l 時）。盡量縮短透析時間。

11.  將提取物從透析袋中移出45 000 g 離心20 min。

12.  用Bradford分析法測定上清中蛋白質(zhì)的濃度。分裝，浸入液氮中速凍，- 80℃保存。