細胞培養(yǎng)技術(shù)服務(wù)

1、 細胞培養(yǎng)服務(wù)流程

① 從動物組織切割、分離所需培養(yǎng)的組織(原代培養(yǎng));

② 用滅菌PBS多次清洗組織，充分剪碎組織，用滅菌PBS清洗組織;

③ 靜置數(shù)分鐘，使組織沉淀于管底，棄上清;

④ *充分消化組織，棄上清;

⑤ 加入含小牛血清或胎牛血清的培養(yǎng)基，置于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng);

⑥ 從CO2培養(yǎng)箱取出生長狀態(tài)良好的單層原代培養(yǎng)細胞或傳代培養(yǎng)細胞，于超凈工作臺中棄去培養(yǎng)液，用滅菌PBS清洗;

⑦ 加入適量*消化液，靜置片刻;

⑧ 倒置顯微鏡下觀察細胞消化狀態(tài)，如變圓，立即棄去消化液，加入培養(yǎng)液終止消化;

⑨ 終止培養(yǎng)，去除培養(yǎng)上清液;

⑩ 反復吹打培養(yǎng)液，制成單細胞懸液，分置于多個細胞培養(yǎng)瓶/皿，進行傳代培養(yǎng);

注：①～⑤為原代細胞培養(yǎng)主要步驟，⑥～⑩為傳代細胞培養(yǎng)主要步驟。

圖1細胞培養(yǎng)流程

2、 細胞培養(yǎng)的原理

細胞培養(yǎng)(cell culture)或組織培養(yǎng)是指把從活體取出的組織細胞，在人工建立的無菌、適當溫度和營養(yǎng)的條件下，模擬其在體內(nèi)的生長環(huán)境使其增殖或分化，并維持結(jié)構(gòu)和功能的一種技術(shù)。該技術(shù)可從細胞或亞細胞水平幫助人類揭示其生、老、病、死的有關(guān)規(guī)律，探索優(yōu)生、抗衰老、防治疾病的手段或途徑，人為地誘導細胞遺傳性狀的改變，使其向更有利于人類和自然界的方向發(fā)展。其中狹義的細胞培養(yǎng)是指：單個細胞或細胞群在體外用人工建立的無菌、合適的溫度和營養(yǎng)以及酸堿度適當?shù)臈l件下，使其生存生長的一種操作技術(shù)。而組織培養(yǎng)( tissue culture)是指在營養(yǎng)及溫度等適當?shù)臈l件下維持組織在體外生長的一種操作方法。在習慣上也泛指所有的體外培養(yǎng)，即器官培養(yǎng)、組織培養(yǎng)和細胞培養(yǎng)的總稱。組織培養(yǎng)是20世紀初[Harrison, 1907; Carrel, 1912]才創(chuàng)建的一種研究動物細胞行為的方法，那時只是為了避開因正常的體內(nèi)自體調(diào)節(jié)以及實驗應(yīng)激所可能產(chǎn)生的機體整體因素的影響。原代細胞培養(yǎng)也稱初代細胞培養(yǎng)，是從供體直接取材獲取細胞后在體外進行的培養(yǎng)。這是建立各種細胞系( cell line)的*步和基礎(chǔ)，。在此期間，細胞的生物學性狀尚未發(fā)生很大變化，仍具有二倍體遺傳特性，在一定程度上能反映體內(nèi)狀態(tài)。此期細胞呈活躍狀態(tài)，可見細胞分裂但不旺盛。原代細胞培養(yǎng)多由各種細胞成分組成，比較復雜，即使是經(jīng)過處理后的細胞，也仍具有異質(zhì)性,主要表現(xiàn)在細胞形態(tài)和大小不一。傳代細胞培養(yǎng)是指原代培養(yǎng)細胞一般經(jīng)過1～4周的培養(yǎng)后，將細胞從一個培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移養(yǎng)瓶的分離過程。在傳代期，細胞一般增殖旺盛，并能維持二倍體核型，大多數(shù)二倍體細胞在培養(yǎng)中維持有限生存期，體外zui多生存1年左右，傳30～50代，相當于150～300個細胞增殖周期。為保持二倍體細胞的特性，細胞應(yīng)在初代培養(yǎng)期或傳代培養(yǎng)早期將部分細胞低溫保存，以防污染等的丟失并備用。

3、 細胞培養(yǎng)優(yōu)點

① 理化環(huán)境的調(diào)控：pH、溫度、滲透壓、O2和CO2的氣壓，它們受到非常的調(diào)節(jié);

② 生理條件可以保持相對恒定：生理條件雖然不能總是被地界定，但可以保持相對恒定，大多數(shù)細胞系的培養(yǎng)仍然需要在培養(yǎng)基中添加血清或其他尚未被確認的成分;

③ 樣品的特征和均一性：組織樣品的異質(zhì)性( heterogeneous)不可避免，但經(jīng)過一次或兩次傳代以后，培養(yǎng)的細胞系會呈現(xiàn)為均一性的(或至少具有相同性質(zhì)的)構(gòu)成。這是因為每次傳代時細胞隨機混合，培養(yǎng)條件的選擇性壓力利于zui有活力的細胞生長，進而產(chǎn)生性質(zhì)較均一的培養(yǎng)物;

④ 經(jīng)濟、規(guī)模和機械化;細胞培養(yǎng)些對種種物質(zhì)的篩選和重復性試驗都較便宜，并且還避免了動物實驗所存在的法律、道德和倫理問題，多孔培養(yǎng)板和自動化技術(shù)方面的新進展也使組織培養(yǎng)在時間和規(guī)模上都更加經(jīng)濟有效;

⑤ 體內(nèi)環(huán)境的體外模擬：灌注培養(yǎng)技術(shù)使特殊實驗成分的釋放在濃度、作用時間及代謝狀態(tài)方面到控制。

4、 細胞培養(yǎng)缺點：

① 需要具備專業(yè)技能：培養(yǎng)技術(shù)必須在嚴格的無菌條件下進行，因為動物細胞的生物，如細菌、真菌、酵母的生長都要慢得多，這就需要操作者具備一定的技術(shù)與知識水平;

② 產(chǎn)量有限：細胞培養(yǎng)的一個主要局限性在于所付出的努力和物質(zhì)只能生產(chǎn)出相當少的一些組織，對于絕大多數(shù)小實驗室(只有兩個或三個人從事組織培養(yǎng))，每批的實際zui大產(chǎn)量可能只有l(wèi)～10g細胞，100g以上的產(chǎn)量則意味著達到了企業(yè)化的小規(guī)模生產(chǎn)水平，這就意味著大多數(shù)實驗室難達到規(guī)?；a(chǎn);

③ 去分化和選擇：許多科學家發(fā)現(xiàn)經(jīng)過幾代的培養(yǎng)，細胞系容易喪失了其來源組織細胞的*表型特征，即去分化;

④ 細胞的起源：不論是什么原因，如果細胞喪失了分化的特性，就很難將培養(yǎng)的細胞與其來源組織中有功能的細胞起來;

⑤ 不穩(wěn)定性：不穩(wěn)定性是許多連續(xù)性細胞系(continuous cell line)所面臨的主要問題，這是由于它們非整倍的染色體組成不穩(wěn)定所導致的。

5、 培養(yǎng)細胞的生長特性

① 貼壁型細胞：大多數(shù)的活體體內(nèi)細胞在體外培養(yǎng)時都需貼附在支持物上生長，這種生長方式稱為貼附依賴性細胞，也稱錨著依存性細胞，一般可分成以下3類：

a:上皮細胞型;

b:成纖維細胞型;

c:游走細胞型;

② 懸浮型細胞:在體外培養(yǎng)時，少數(shù)類型的細胞呈懸浮狀態(tài)生長，在瓶皿內(nèi)不貼壁，其生存空間大，能繁殖大量細胞，容易進行傳代培養(yǎng)，但在觀察細胞病變時不如貼壁細胞,如血液中的淋巴細胞、白細胞、脾、骨髓細胞以及某些腫瘤細胞等均屬于此型細胞，觀察時的形態(tài)多呈圓形;

6、 培養(yǎng)細胞所需材料

① 培養(yǎng)細胞試劑：

a:培養(yǎng)液，如MEM、DMEM、IMDM、RPMI1640等;

b:胎牛血清或小牛血清;

e:PBS緩沖液;

f:*消化液;

② 培養(yǎng)細胞耗材：

a:組織或傳代培養(yǎng)細胞;

b:細胞培養(yǎng)瓶/皿、離心管、細胞培養(yǎng)板;

c:無菌的tip頭、吸管、滴管、吹打管;

d:刀、剪、鑷等解剖用具(用于原代培養(yǎng));

e:乙醇(用于原代培養(yǎng));

f:細胞計數(shù)器;

g:細胞凍存管;

③ 儀器設(shè)備：

a: CO2培養(yǎng)箱(圖2);

b:恒溫水浴箱(圖3);

c:高壓蒸氣滅菌器;

d:玻璃濾器和微量超濾膜濾器;

e:離心機;

f:液氮罐;

g:無菌操作室和超凈工作臺(圖4);

h:普通顯微鏡、倒置顯微鏡等;

圖2 CO2培養(yǎng)箱 圖3恒溫水浴箱 圖4超凈工作臺

7、 材料要求

① 組織取材、切割等過程中充分清洗;

② 干凈組織量新鮮;

③ 避免組織\細胞污染;

④ 實驗材料涉及危險品，loogene公司不予服務(wù);

⑤ 提供盡量詳細的實驗背景材料。

8、 實驗周期

① 1-10個樣本，20個工作日

② 10-100個樣本，30個工作日

③ 100個樣本以上，60個工作日

注：根據(jù)原代細胞培養(yǎng)或傳代細胞培養(yǎng)以及細胞本身特性不同，實驗時間有較大差異。

9、 提供結(jié)果

完整的實驗操作步驟、對數(shù)生長期細胞或凍存狀態(tài)的細胞、原代培養(yǎng)細胞、顯微鏡下細胞生長狀態(tài)圖(圖5)等結(jié)果。

圖5 細胞生長狀態(tài)