細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)服務(wù)

1、 細(xì)胞培養(yǎng)服務(wù)流程

① 從動(dòng)物組織切割、分離所需培養(yǎng)的組織(原代培養(yǎng));

② 用滅菌PBS多次清洗組織，充分剪碎組織，用滅菌PBS清洗組織;

③ 靜置數(shù)分鐘，使組織沉淀于管底，棄上清;

④ *充分消化組織，棄上清;

⑤ 加入含小牛血清或胎牛血清的培養(yǎng)基，置于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng);

⑥ 從CO2培養(yǎng)箱取出生長(zhǎng)狀態(tài)良好的單層原代培養(yǎng)細(xì)胞或傳代培養(yǎng)細(xì)胞，于超凈工作臺(tái)中棄去培養(yǎng)液，用滅菌PBS清洗;

⑦ 加入適量*消化液，靜置片刻;

⑧ 倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞消化狀態(tài)，如變圓，立即棄去消化液，加入培養(yǎng)液終止消化;

⑨ 終止培養(yǎng)，去除培養(yǎng)上清液;

⑩ 反復(fù)吹打培養(yǎng)液，制成單細(xì)胞懸液，分置于多個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)瓶/皿，進(jìn)行傳代培養(yǎng);

注：①～⑤為原代細(xì)胞培養(yǎng)主要步驟，⑥～⑩為傳代細(xì)胞培養(yǎng)主要步驟。

圖1細(xì)胞培養(yǎng)流程

2、 細(xì)胞培養(yǎng)的原理

細(xì)胞培養(yǎng)(cell culture)或組織培養(yǎng)是指把從活體取出的組織細(xì)胞，在人工建立的無(wú)菌、適當(dāng)溫度和營(yíng)養(yǎng)的條件下，模擬其在體內(nèi)的生長(zhǎng)環(huán)境使其增殖或分化，并維持結(jié)構(gòu)和功能的一種技術(shù)。該技術(shù)可從細(xì)胞或亞細(xì)胞水平幫助人類揭示其生、老、病、死的有關(guān)規(guī)律，探索優(yōu)生、抗衰老、防治疾病的手段或途徑，人為地誘導(dǎo)細(xì)胞遺傳性狀的改變，使其向更有利于人類和自然界的方向發(fā)展。其中狹義的細(xì)胞培養(yǎng)是指：?jiǎn)蝹€(gè)細(xì)胞或細(xì)胞群在體外用人工建立的無(wú)菌、合適的溫度和營(yíng)養(yǎng)以及酸堿度適當(dāng)?shù)臈l件下，使其生存生長(zhǎng)的一種操作技術(shù)。而組織培養(yǎng)( tissue culture)是指在營(yíng)養(yǎng)及溫度等適當(dāng)?shù)臈l件下維持組織在體外生長(zhǎng)的一種操作方法。在習(xí)慣上也泛指所有的體外培養(yǎng)，即器官培養(yǎng)、組織培養(yǎng)和細(xì)胞培養(yǎng)的總稱。組織培養(yǎng)是20世紀(jì)初[Harrison, 1907; Carrel, 1912]才創(chuàng)建的一種研究動(dòng)物細(xì)胞行為的方法，那時(shí)只是為了避開因正常的體內(nèi)自體調(diào)節(jié)以及實(shí)驗(yàn)應(yīng)激所可能產(chǎn)生的機(jī)體整體因素的影響。原代細(xì)胞培養(yǎng)也稱初代細(xì)胞培養(yǎng)，是從供體直接取材獲取細(xì)胞后在體外進(jìn)行的培養(yǎng)。這是建立各種細(xì)胞系( cell line)的*步和基礎(chǔ)，。在此期間，細(xì)胞的生物學(xué)性狀尚未發(fā)生很大變化，仍具有二倍體遺傳特性，在一定程度上能反映體內(nèi)狀態(tài)。此期細(xì)胞呈活躍狀態(tài)，可見細(xì)胞分裂但不旺盛。原代細(xì)胞培養(yǎng)多由各種細(xì)胞成分組成，比較復(fù)雜，即使是經(jīng)過處理后的細(xì)胞，也仍具有異質(zhì)性,主要表現(xiàn)在細(xì)胞形態(tài)和大小不一。傳代細(xì)胞培養(yǎng)是指原代培養(yǎng)細(xì)胞一般經(jīng)過1～4周的培養(yǎng)后，將細(xì)胞從一個(gè)培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移養(yǎng)瓶的分離過程。在傳代期，細(xì)胞一般增殖旺盛，并能維持二倍體核型，大多數(shù)二倍體細(xì)胞在培養(yǎng)中維持有限生存期，體外zui多生存1年左右，傳30～50代，相當(dāng)于150～300個(gè)細(xì)胞增殖周期。為保持二倍體細(xì)胞的特性，細(xì)胞應(yīng)在初代培養(yǎng)期或傳代培養(yǎng)早期將部分細(xì)胞低溫保存，以防污染等的丟失并備用。

3、 細(xì)胞培養(yǎng)優(yōu)點(diǎn)

① 理化環(huán)境的調(diào)控：pH、溫度、滲透壓、O2和CO2的氣壓，它們受到非常的調(diào)節(jié);

② 生理?xiàng)l件可以保持相對(duì)恒定：生理?xiàng)l件雖然不能總是被地界定，但可以保持相對(duì)恒定，大多數(shù)細(xì)胞系的培養(yǎng)仍然需要在培養(yǎng)基中添加血清或其他尚未被確認(rèn)的成分;

③ 樣品的特征和均一性：組織樣品的異質(zhì)性( heterogeneous)不可避免，但經(jīng)過一次或兩次傳代以后，培養(yǎng)的細(xì)胞系會(huì)呈現(xiàn)為均一性的(或至少具有相同性質(zhì)的)構(gòu)成。這是因?yàn)槊看蝹鞔鷷r(shí)細(xì)胞隨機(jī)混合，培養(yǎng)條件的選擇性壓力利于zui有活力的細(xì)胞生長(zhǎng)，進(jìn)而產(chǎn)生性質(zhì)較均一的培養(yǎng)物;

④ 經(jīng)濟(jì)、規(guī)模和機(jī)械化;細(xì)胞培養(yǎng)些對(duì)種種物質(zhì)的篩選和重復(fù)性試驗(yàn)都較便宜，并且還避免了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)所存在的法律、道德和倫理問題，多孔培養(yǎng)板和自動(dòng)化技術(shù)方面的新進(jìn)展也使組織培養(yǎng)在時(shí)間和規(guī)模上都更加經(jīng)濟(jì)有效;

⑤ 體內(nèi)環(huán)境的體外模擬：灌注培養(yǎng)技術(shù)使特殊實(shí)驗(yàn)成分的釋放在濃度、作用時(shí)間及代謝狀態(tài)方面到控制。

4、 細(xì)胞培養(yǎng)缺點(diǎn)：

① 需要具備專業(yè)技能：培養(yǎng)技術(shù)必須在嚴(yán)格的無(wú)菌條件下進(jìn)行，因?yàn)閯?dòng)物細(xì)胞的生物，如細(xì)菌、真菌、酵母的生長(zhǎng)都要慢得多，這就需要操作者具備一定的技術(shù)與知識(shí)水平;

② 產(chǎn)量有限：細(xì)胞培養(yǎng)的一個(gè)主要局限性在于所付出的努力和物質(zhì)只能生產(chǎn)出相當(dāng)少的一些組織，對(duì)于絕大多數(shù)小實(shí)驗(yàn)室(只有兩個(gè)或三個(gè)人從事組織培養(yǎng))，每批的實(shí)際zui大產(chǎn)量可能只有l(wèi)～10g細(xì)胞，100g以上的產(chǎn)量則意味著達(dá)到了企業(yè)化的小規(guī)模生產(chǎn)水平，這就意味著大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室難達(dá)到規(guī)?；a(chǎn);

③ 去分化和選擇：許多科學(xué)家發(fā)現(xiàn)經(jīng)過幾代的培養(yǎng)，細(xì)胞系容易喪失了其來(lái)源組織細(xì)胞的*表型特征，即去分化;

④ 細(xì)胞的起源：不論是什么原因，如果細(xì)胞喪失了分化的特性，就很難將培養(yǎng)的細(xì)胞與其來(lái)源組織中有功能的細(xì)胞起來(lái);

⑤ 不穩(wěn)定性：不穩(wěn)定性是許多連續(xù)性細(xì)胞系(continuous cell line)所面臨的主要問題，這是由于它們非整倍的染色體組成不穩(wěn)定所導(dǎo)致的。

5、 培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)特性

① 貼壁型細(xì)胞：大多數(shù)的活體體內(nèi)細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)都需貼附在支持物上生長(zhǎng)，這種生長(zhǎng)方式稱為貼附依賴性細(xì)胞，也稱錨著依存性細(xì)胞，一般可分成以下3類：

a:上皮細(xì)胞型;

b:成纖維細(xì)胞型;

c:游走細(xì)胞型;

② 懸浮型細(xì)胞:在體外培養(yǎng)時(shí)，少數(shù)類型的細(xì)胞呈懸浮狀態(tài)生長(zhǎng)，在瓶皿內(nèi)不貼壁，其生存空間大，能繁殖大量細(xì)胞，容易進(jìn)行傳代培養(yǎng)，但在觀察細(xì)胞病變時(shí)不如貼壁細(xì)胞,如血液中的淋巴細(xì)胞、白細(xì)胞、脾、骨髓細(xì)胞以及某些腫瘤細(xì)胞等均屬于此型細(xì)胞，觀察時(shí)的形態(tài)多呈圓形;

6、 培養(yǎng)細(xì)胞所需材料

① 培養(yǎng)細(xì)胞試劑：

a:培養(yǎng)液，如MEM、DMEM、IMDM、RPMI1640等;

b:胎牛血清或小牛血清;

e:PBS緩沖液;

f:*消化液;

② 培養(yǎng)細(xì)胞耗材：

a:組織或傳代培養(yǎng)細(xì)胞;

b:細(xì)胞培養(yǎng)瓶/皿、離心管、細(xì)胞培養(yǎng)板;

c:無(wú)菌的tip頭、吸管、滴管、吹打管;

d:刀、剪、鑷等解剖用具(用于原代培養(yǎng));

e:乙醇(用于原代培養(yǎng));

f:細(xì)胞計(jì)數(shù)器;

g:細(xì)胞凍存管;

③ 儀器設(shè)備：

a: CO2培養(yǎng)箱(圖2);

b:恒溫水浴箱(圖3);

c:高壓蒸氣滅菌器;

d:玻璃濾器和微量超濾膜濾器;

e:離心機(jī);

f:液氮罐;

g:無(wú)菌操作室和超凈工作臺(tái)(圖4);

h:普通顯微鏡、倒置顯微鏡等;

圖2 CO2培養(yǎng)箱 圖3恒溫水浴箱 圖4超凈工作臺(tái)

7、 材料要求

① 組織取材、切割等過程中充分清洗;

② 干凈組織量新鮮;

③ 避免組織\細(xì)胞污染;

④ 實(shí)驗(yàn)材料涉及危險(xiǎn)品，loogene公司不予服務(wù);

⑤ 提供盡量詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)背景材料。

8、 實(shí)驗(yàn)周期

① 1-10個(gè)樣本，20個(gè)工作日

② 10-100個(gè)樣本，30個(gè)工作日

③ 100個(gè)樣本以上，60個(gè)工作日

注：根據(jù)原代細(xì)胞培養(yǎng)或傳代細(xì)胞培養(yǎng)以及細(xì)胞本身特性不同，實(shí)驗(yàn)時(shí)間有較大差異。

9、 提供結(jié)果

完整的實(shí)驗(yàn)操作步驟、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞或凍存狀態(tài)的細(xì)胞、原代培養(yǎng)細(xì)胞、顯微鏡下細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)圖(圖5)等結(jié)果。

圖5 細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)