MTT技術(shù)服務(wù)

1、 MTT服務(wù)流程

① 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞并計(jì)數(shù);

② 接種細(xì)胞;配成單細(xì)胞懸液，接種于96孔板，接種密度為每孔103-104;

③ 培養(yǎng)細(xì)胞：5%CO2，37℃孵育，培養(yǎng)1天～5天(需根據(jù)試驗(yàn)?zāi)康暮鸵鬀Q定培養(yǎng)時(shí)間);

④ 加入MTT溶液，繼續(xù)孵育4 h～6h;

⑤ 終止培養(yǎng)，去除培養(yǎng)上清液;

⑥ 加入DMSO，脫色搖床振蕩10min，使結(jié)晶物充分融解;

⑦ 酶聯(lián)免疫監(jiān)測(cè)儀選擇490nm或570nm波長(zhǎng)，測(cè)定各孔光吸收值;

⑧ 記錄結(jié)果，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

2、 MTT原理

3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽{3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenylt-

etrazolium bromide，MTT｝，商品名為噻唑藍(lán)，是一種黃顏色的染料。MTT比色法是一種檢測(cè)細(xì)胞存活和生長(zhǎng)的方法，其檢測(cè)原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚(Formazan)并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。二甲基亞砜(DMSO)能溶解細(xì)胞中的甲瓚，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490nm或570nm波長(zhǎng)處，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測(cè)儀上測(cè)定各孔光吸收值。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比，根據(jù)測(cè)得的吸光度值(OD值)來判斷活細(xì)胞數(shù)量，OD值越大，細(xì)胞活性越強(qiáng)(如果是測(cè)藥物毒性，則表示藥物毒性越小)(圖1)。該方法已廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測(cè)、大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、細(xì)胞毒性試驗(yàn)以及腫瘤放射敏感性測(cè)定等。

圖1 MTT檢測(cè)原理

3、 MTT應(yīng)用

① 細(xì)胞增殖程度的測(cè)定;

② 細(xì)胞活性的測(cè)定;

③ 藥物或其他因素對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的毒性測(cè)定;

4、 MTT比色法原則

① 設(shè)空白對(duì)照;

② 培養(yǎng)細(xì)胞的濃度應(yīng)合適：通常情況下每孔103～104個(gè);

③ 培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)應(yīng)合適;

④ 避免胎牛/小牛血清干擾：一般選小于10%的胎牛/小牛血清的培養(yǎng)細(xì)胞，顯色后盡量清洗培養(yǎng)基;

⑤ 吸光度范圍以0～0.7為宜，超出范圍后不是線性關(guān)系被破壞;

⑥ 加入DMSO后應(yīng)在在脫色搖床上振蕩10～15min，然后測(cè)吸光值;

⑦ 每孔鋪的細(xì)胞數(shù)目應(yīng)均勻一致。

5、 MTT所需材料

① MTT試劑：

a: 0.5% MTT溶液(5mg/ml)

b:胎牛血清或小牛血清;

c: RPMI 1640培養(yǎng)基;

d:DMSO;

e:PBS緩沖液;

f:*消化液;

② MTT耗材：

a:待檢樣本(培養(yǎng)細(xì)胞);

b:96孔培養(yǎng)板;

c:無菌的tip頭;

③ 儀器：

a:濕式CO2培養(yǎng)箱(圖2);

b:酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(圖3);

c:脫色搖床;

d:臺(tái)式離心機(jī)

圖2濕式CO2培養(yǎng)箱 圖3酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀

6、 材料要求

① 避免細(xì)胞污染;

② 呈色后盡量清除培養(yǎng)基，尤其是清除胎牛/小牛血清;

③ 實(shí)驗(yàn)材料涉及危險(xiǎn)品，loogene公司不予服務(wù);

④ 待檢細(xì)胞盡量新鮮，待測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好;

⑤ 提供盡量詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)背景材料。

7、 實(shí)驗(yàn)周期

① 1-10個(gè)樣本，7個(gè)工作日

② 10-100個(gè)樣本，10個(gè)工作日

③ 100個(gè)樣本以上，20個(gè)工作日

8、 提供結(jié)果

完整的實(shí)驗(yàn)操作步驟、吸光度值、細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(圖1)、MTT統(tǒng)計(jì)分析(圖4)等結(jié)果。

圖4 MTT統(tǒng)計(jì)分析