Hi T7高產(chǎn)RNA合成試劑盒

描述：Hi T7 高產(chǎn) RNA 合成試劑盒可在體外高效合成多種類 型的 RNA 如 mRNA、lncRNA、shRNA 等。利用 Hi T7 RNA 聚合酶識別 T7 promoterTTCTAATACGACTCACTATAG G）以方框中 G 堿基為起點開始轉(zhuǎn)錄，該試劑盒可以從少量 樣本得到高效轉(zhuǎn)錄，單次反應(yīng)可獲得高達 150-200 μg 的產(chǎn) 物，轉(zhuǎn)錄長度可達 4000nt 以上。 利用該試劑盒得到的 RNA 適用于多種下游應(yīng)用，如 RNA 結(jié)構(gòu)和功能研究、核酸酶生物化學(xué)研究、RNase 保護 分析探針、印跡雜交、反義 RNA 及 RNAi 實驗、微陣列 分析、顯微注射、體外翻譯和 RNA 疫苗等。 Hi T7 高產(chǎn) RNA 合成試劑盒使用方便，使用優(yōu)化好的預(yù) 混液，有利于用戶快速建立反應(yīng)。本試劑盒還配備了 DNase I，在 RNA 合成完畢后可快速去除 DNA 模板，便于獲得高 純度轉(zhuǎn)錄 RNA。

組分：

(1) 2×Hi T7 Trans Solution 中包含反應(yīng) Buffer、rNTP。
(2) T7 Trans Enzyme Mix 中包含 Hi T7 RNA 聚合酶、
Rnase Inhibitor 等。
保存：
-20℃可保存 2 年，避免反復(fù)凍融。
操作步驟：
（1） 按以下組分配制反應(yīng)液
2×Hi T7 Trans Solution 10 μl
DNA（RNase Free） 0.5~1 μg
Hi T7 Trans Enzyme Mix 1.5 μl
RNase Free H2O upto 20 μl
（2）37℃反應(yīng) 4h，轉(zhuǎn)錄 RNA 產(chǎn)量在 120~200 μg。
（3） 轉(zhuǎn)錄完畢后，向反應(yīng)液中加入 2.5 μl 的 10xRD Buffer和 2 μl 的 RNase Free DNase I，37℃孵育 15min，以去除DNA 模板。
（4）整個反應(yīng)完畢后可取 0.05~0.1 μl 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行電泳檢測，并凍存于-80℃保存。選用 LiCl 沉淀純化或 5min RNAPurification Kit 進行轉(zhuǎn)錄 RNA 的純化，以去除鹽、rNTP、蛋白等。

一、模板DNA：PCR反應(yīng)需要模板DNA，如從細胞、組織、血液中提取DNA等；

二、引物：PCR反應(yīng)的兩個引物，分別與模板DNA的兩端配對擴增所需的特定區(qū)域，引物也可以合成為TA克隆等過程中使用到的引物；

三、dNTPs：PCR反應(yīng)中需要四種dNTPs，包括脫氧腺苷酸（dATP）、脫氧胸苷酸（dCTP）、脫氧鳥苷酸（dGTP）、脫氧胞嘧啶酸（dTTP），用于細胞分裂、DNA合成         等生物學(xué)過程，用于PCR擴增的模板DNA鏈的延伸和擴增；

四、Taq DNA聚合酶：PCR反應(yīng)需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，還有一些其他種類的聚合酶如PFU、Phusion等，用于擴增DNA鏈；

五、PCR buffer溶液：對PCR反應(yīng)具有緩沖作用，調(diào)節(jié)反應(yīng)pH，硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機化合物如甲醛，可增強PCR反應(yīng)特異性，從而提高反應(yīng)效率；

六、酶切體系：PCR擴增往往涉及到重組、構(gòu)建和測序等等實驗步驟，常常需要進行酶切操作。

七、MARK:一種分子量標(biāo)準(zhǔn)，用來判別DNA片段大小的工具。

八、DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物；

①Oligo dT
選擇Oligo dT時，要求RNA必須有Poly A，所以真核生物的mRNA都適用。適合長鏈甚至全長mRNA的RT，對RNA樣品的質(zhì)量要求較高，不要有明顯的DNA污染、RNA降解和RNA斷裂。假如想探索新的mRNA進行RT反應(yīng)，建議推薦使用Oligo dT引物。使用Oligo dT引物要比隨機引物和特異性引物的穩(wěn)定性要好。
②隨機引物
適合各種RNA的RT，尤其適合模板豐度很低的情況（比如某個gene表達量很低）。選擇隨機引物時，鏈cDNA合成反應(yīng)中就是以所有的RNA為模板，然后進行PCR反應(yīng)時設(shè)計引物進行特異性擴增。同時要注意隨機引物的量和總RNA量之間的關(guān)系，一般建議每5µg總RNA的隨機引物的用量為50ng，如果每5µg總RNA的隨機引物的用量超過250ng，可能會導(dǎo)致小片段產(chǎn)物（＜500bp）的增加和長片段、全長產(chǎn)物的降低。
③特異性引物
基因特異性引物（GSP）是某個基因序列的一部分，與模板互補的引物。該引物需要結(jié)合目標(biāo)RNA的已知序列進行設(shè)計。由于引物和RNA序列特異性結(jié)合，每個目標(biāo)RNA都需要一套新的基因特異性引物。因此，當(dāng)分析多種目標(biāo)時，則需要適用更多的RNA樣本。而且不同引物退火溫度本來就不相同，所以一般不推薦使用。如需要使用特異性引物，建議對退火溫度進行優(yōu)化。