本試劑盒采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)技術(shù)。特異性抗Mouse IL-4 抗體預(yù)包被在高親和力的酶標(biāo)板上。酶標(biāo)板孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品、待測(cè)樣本和化的檢測(cè)抗體,經(jīng)過(guò)孵育,樣本中存在的Mouse IL-4 與固相抗體和檢測(cè)抗體結(jié)合。洗滌去除未結(jié)合的物質(zhì)后,加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素(Streptavidin-HRP)。洗滌后,加入顯色底物 TMB,避光顯色。顏色反應(yīng)的深淺與樣本中Mouse IL-4 的濃度成正比。加入終止液終止反應(yīng),在 450 nm 波長(zhǎng)(參考波長(zhǎng) 570 - 630 nm)測(cè)定吸光度值。本試劑盒采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)技術(shù)。特異性抗Mouse IL-4 抗體預(yù)包被在高親和力的酶標(biāo)板上。酶標(biāo)板孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品、待測(cè)樣本和化的檢測(cè)抗體,經(jīng)過(guò)孵育,樣本中存在的Mouse IL-4 與固相抗體和檢測(cè)抗體結(jié)合。洗滌去除未結(jié)合的物質(zhì)后,加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素(Streptavidin-HRP)。洗滌后,加入顯色底物 TMB,避光顯色。顏色反應(yīng)的深淺與樣本中Mouse IL-4 的濃度成正比。加入終止液終止反應(yīng),在 450 nm 波長(zhǎng)(參考波長(zhǎng) 570 - 630 nm)測(cè)定吸光度值。
本試劑盒采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)技術(shù)。特異性抗Mouse IL-4 抗體預(yù)包被在高親和力的酶標(biāo)板上。酶標(biāo)板孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品、待測(cè)樣本和化的檢測(cè)抗體,經(jīng)過(guò)孵育,樣本中存在的Mouse IL-4 與固相抗體和檢測(cè)抗體結(jié)合。洗滌去除未結(jié)合的物質(zhì)后,加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素(Streptavidin-HRP)。洗滌后,加入顯色底物 TMB,避光顯色。顏色反應(yīng)的深淺與樣本中Mouse IL-4 的濃度成正比。加入終止液終止反應(yīng),在 450 nm 波長(zhǎng)(參考波長(zhǎng) 570 - 630 nm)測(cè)定吸光度值。
樣本采集與貯存收起
1. 細(xì)胞培養(yǎng)上清
300 × g 離心 10 分鐘去除沉淀物,即刻檢測(cè),或者分裝,-20℃以下貯存。
2. 血清樣本
離心管收集血清。血樣凝集 30 分鐘后,1,000 × g 離心 10 分鐘。吸取血清樣本之后即刻檢測(cè),或者分裝,-20℃以下貯存。
3. 血漿樣本
EDTA、或肝素抗凝收集血漿樣本。1,000 × g 離心 30 分鐘收集樣本。即刻檢測(cè),或者分裝,-20℃以下貯存。本試劑盒可能適用于其它生物學(xué)樣本。細(xì)胞培養(yǎng)上清、血清和血漿已經(jīng)過(guò)驗(yàn)證。
試劑盒提供的材料收起
自備材料收起
1) 能夠檢測(cè) 450 nm 吸光度的酶標(biāo)儀,參考波長(zhǎng) 570 nm 或 630 nm
2) 移液器及槍頭、加樣槽
3) 準(zhǔn)備試劑用的試管、離心管、量筒等
4) 蒸餾水或去離子水
5) 渦旋振蕩器、微孔板振蕩器
試劑準(zhǔn)備收起
檢測(cè)前請(qǐng)將所有的試劑、樣本恢復(fù)至室溫(18℃-28℃)。如果濃縮的試劑出現(xiàn)結(jié)晶,37℃溫浴,直至結(jié)晶全部溶解。
1×洗液
吸取 20×濃縮洗液 50 ml 至 1 L 的量筒,加蒸餾水至 1,000 ml,輕輕混勻,避免泡沫。轉(zhuǎn)移至干凈瓶?jī)?nèi)。2 - 25℃貯存,1×洗液可穩(wěn)定保存 30 天。
1×檢測(cè)緩沖液
吸取 10×濃縮檢測(cè)緩沖液 5 ml 至 100 ml 量筒,加蒸餾水至 50 ml,輕輕混勻,避免泡沫。2 - 8℃貯存,1×檢測(cè)緩沖液可穩(wěn)定保存 30 天。
試劑盒保存于 2 - 8℃,有效期標(biāo)注于標(biāo)簽上。
技術(shù)要點(diǎn)收起
1) 重溶或者混合蛋白的時(shí)候,始終避免氣泡產(chǎn)生。
2) 避免交叉污染,在進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品加樣、樣本加樣,以及不同試劑加樣的時(shí)候,請(qǐng)更換槍頭。不同的試劑,使用不同的加樣槽。
3) 在應(yīng)用自動(dòng)洗板機(jī)時(shí),加入洗液之后,設(shè)置 30 秒的浸泡程序,或者在不同的洗滌步驟將微孔板掉轉(zhuǎn) 180 度,這樣可以提高分析的準(zhǔn)確度。
4) 為保證結(jié)果的精確性,孵育時(shí)封好封板膜。
5) 顯色底物在添加之前應(yīng)是無(wú)色的。保持顯色底物始終處于避光態(tài)。
6) 終止液的添加順序應(yīng)與顯色底物的添加順序相同。
添加終止液之后,底物的顏色應(yīng)由藍(lán)色轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色。如果底物呈現(xiàn)綠色,說(shuō)明終止液與顯色底物沒(méi)有充分混勻。
7) 推薦所有的檢測(cè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品在檢測(cè)中設(shè)復(fù)孔。
8) 在任何情況下,避免接觸微孔板的內(nèi)表面。
操作步驟收起
檢測(cè)之前請(qǐng)將所有的試劑、樣本平衡至室溫。
1) 準(zhǔn)備好所有需要的試劑及工作濃度標(biāo)準(zhǔn)品。
2) 將不需要的板條拆卸下來(lái),放回裝有干燥劑的鋁箔袋,重新封好封口。
3) 浸泡酶標(biāo)板:加入 300μl 1×洗液靜置浸泡 30 秒。為了獲得理想的實(shí)驗(yàn)結(jié)果浸泡是必須的。棄掉洗液之后,在吸水紙上將微孔板拍干。洗板完成之后,請(qǐng)立即使用微孔板,不要讓微孔板干燥。
4) 加標(biāo)準(zhǔn)品:標(biāo)準(zhǔn)品孔加入 100μl 2倍倍比稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品??瞻卓准尤?100μl 1×檢測(cè)緩沖液(血清/血漿樣本)或培養(yǎng)基
(細(xì)胞培養(yǎng)上清樣本)。
5) 加樣本:血清/血漿:樣本孔加入 80μl 1×檢測(cè)緩沖液和 20μl 樣本。細(xì)胞培養(yǎng)上清:樣本孔加入 100μl 細(xì)胞培養(yǎng)上
清。保證步驟 4、5 連續(xù)加樣,不要間斷。加樣過(guò)程在 15 分鐘內(nèi)完成。
6) 孵育:使用封板膜封板。300 轉(zhuǎn)/分鐘振蕩,室溫孵育 1.5 小時(shí)。
7) 洗滌:棄掉液體,每孔加入 300μl 洗液洗板,洗滌 6 次。每次洗板,在吸水紙上拍干。為獲得理想的實(shí)驗(yàn)性能,必
須移除殘留液體。
8) 加檢測(cè)抗體:每孔加入 100μl 稀釋的檢測(cè)抗體(1:100 稀釋)。使用封板膜封板。300 轉(zhuǎn)/分鐘振蕩,室溫孵育 30 分鐘。
9) 洗滌:重復(fù)步驟 7。
10) 加酶孵育:每孔加入 100μl 稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素(1:100 稀釋)。使用新的封板膜封板。300 轉(zhuǎn)/分
鐘振蕩,室溫孵育 30 分鐘。
11) 洗滌:重復(fù)步驟 7。
12) 加信號(hào)增強(qiáng)劑孵育:每孔加入 100μl 稀釋的信號(hào)增強(qiáng)劑(1:100 稀釋)。使用新的封板膜封板。300 轉(zhuǎn)/分鐘振蕩,室溫
精確孵育 15 分鐘。
13) 洗滌:重復(fù)步驟 7。
14) 再次加酶孵育:每孔加入 100μl 稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素(1:100 稀釋)。使用新的封板膜封板。300
轉(zhuǎn)/分鐘振蕩,室溫精確孵育 15 分鐘。
15) 洗滌:重復(fù)步驟 7。
16) 加底物顯色:每孔加入 100μl 顯色底物 TMB,避光,室溫孵育 5 - 30 分鐘。
17) 加終止液:每孔加入 100μl 終止液。顏色由藍(lán)色變?yōu)辄S色。如果顏色呈現(xiàn)綠色或者顏色的變化明顯不均勻,請(qǐng)輕輕
叩擊板框,充分混勻。
18) 檢測(cè)讀數(shù):在 30 分鐘之內(nèi),使用酶標(biāo)儀進(jìn)行雙波長(zhǎng)檢測(cè),測(cè)定 450 nm 最大吸收波長(zhǎng)和 570 nm 或 630 nm 參考波長(zhǎng)
下的 OD 值。校準(zhǔn)后的 OD 值為 450 nm 的測(cè)定值減去 570 nm 或 630 nm 的測(cè)定值。僅使用 450 nm 測(cè)定會(huì)導(dǎo)致 OD
值偏高,并且準(zhǔn)確度降低。
結(jié)果計(jì)算收起
試劑盒性能收起
1) 準(zhǔn)確性:標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值,大于等于0.99;
2) 靈敏度:檢測(cè)濃度小于50pg/mL;
3) 特異性:不與其他可溶性結(jié)構(gòu)類似物交叉反應(yīng);
4) 重復(fù)性:板內(nèi)變異系數(shù)小于10%、板間變異系數(shù)小于15%;
5) 貯藏:2-8°C,遊光防潮保存;
6) 有效期:6個(gè)月。