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南京億迅生物科技有限公司
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腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶
2019-11-19 閱讀(348)
| 提 供 商 | 南京億迅生物科技有限公司 | 資料大小 | 26.5KB |
|---|---|---|---|
| 資料圖片 | 下載次數(shù) | 69次 | |
| 資料類型 | WORD 文檔 | 瀏覽次數(shù) | 348次 |
測(cè)定意義
AGP (EC 2.7.7.21)主要存在于植物中，催化葡萄糖-1-磷酸與ATP反應(yīng)生成淀粉合成的直接前體ADPG，是植物淀粉生物合成的主要限速步驟。
測(cè)定原理
AGP催化的逆向反應(yīng)生成G1P，在反應(yīng)體系中添加的磷酸己糖變位酶和6-磷酸葡萄糖脫氫酶依次催化生成6-磷酸葡萄糖酸和NADPH，340nm下測(cè)定NADPH增加速率，即可計(jì)算AGP活性。
需自備的的儀器和用品
紫外分光光度計(jì)、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1 mL石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水
試劑的組成和配制
提取液：液體30mL×1瓶，4℃保存;
試劑一：液體10mL×1瓶，4℃保存；
試劑二：粉劑×1支，4℃保存；臨用前加入250μL雙蒸水充分溶解備用；用不完的試劑仍4℃保存；
試劑三：粉劑×1瓶，4℃保存；臨用前加入2mL雙蒸水充分溶解備用；用不完的試劑仍4℃保存；
試劑四：粉劑×1瓶，4℃保存；臨用前加入3mL雙蒸水充分溶解備用；用不完的試劑仍4℃保存；
試劑五：粉劑×1瓶，-20℃保存；臨用前加入3mL雙蒸水充分溶解備用；用不完的試劑仍-20℃保存；
試劑六：粉劑×1支，-20℃保存；臨用前加入250μL雙蒸水充分溶解備用；用不完的試劑4℃保存；
試劑七：粉劑×1支，-20℃保存；臨用前加入250μL雙蒸水充分溶解備用；用不完的試劑4℃保存；
粗酶液制備
稱取約0.1g組織加入1mL提取液，冰浴中勻漿。10000g ，4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。
測(cè)定步驟（在1.5mL EP管中依次加入下列試劑）：
試劑名稱（μL） | 測(cè)定管 |
試劑一 | 100 |
試劑二 | 10 |
試劑三 | 50 |
試劑四 | 100 |
樣本 | 20 |
混勻，30℃保溫15 min，置沸水浴中1 min（蓋緊，防止水分散失），冰浴迅速冷卻
試劑五 | 100 |
試劑一 | 300 |
試劑六 | 10 |
試劑七 | 10 |
混勻后立即在340 nm波長(zhǎng)下記錄初始吸光度A1和 2min后的吸光度A2，計(jì)算ΔA=A2-A1。
AGP活性計(jì)算
1、按樣本蛋白濃度計(jì)算：
單位的定義：每mg組織蛋白在反應(yīng)體系中每分鐘催化產(chǎn)生1nmol NADPH定義為一個(gè)酶活性單位。
AGP活性（U/mg prot）＝反應(yīng)總體積（700μL ）÷樣本體積（20μL ）÷反應(yīng)時(shí)間(2min)÷NADPH消光系數(shù)（6.22×10-3）×ΔA÷蛋白質(zhì)濃度（mg/mL）=2813×ΔA÷蛋白質(zhì)濃度（mg/mL）。
此法需要自行測(cè)定粗酶液蛋白質(zhì)濃度。
2、按照樣本鮮重計(jì)算
單位的定義：每g組織在反應(yīng)體系中每分鐘催化產(chǎn)生1nmol NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。
AGP活性（U/g 鮮重）=反應(yīng)總體積（700μL ）÷樣本體積（20μL ）÷反應(yīng)時(shí)間(2min)÷NADPH消光系數(shù)（6.22×10-3）×ΔA ÷樣本鮮重(g/mL) =2813×ΔA÷樣本鮮重(g/mL)
