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南京億迅生物科技有限公司
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乙醇脫氫酶（ADH）活性測定試劑盒
2019-11-19 閱讀(308)
| 提 供 商 | 南京億迅生物科技有限公司 | 資料大小 | 30.5KB |
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| 資料圖片 | 下載次數(shù) | 39次 | |
| 資料類型 | WORD 文檔 | 瀏覽次數(shù) | 308次 |
測定意義：
ADH是生物體內(nèi)短鏈醇代謝的關(guān)鍵酶，催化乙醇與乙醛可逆轉(zhuǎn)換，在很多生理過程中起著重要作用。哺乳動物ADH主要在肝臟生成，肝臟損傷導(dǎo)致ADH釋放到血清中。血清ADH活性高低反映了肝功能是否異常。
測定原理：
ADH催化NADH還原乙醛生成乙醇和NAD+，NADH在340nm處有吸收峰，而NAD+沒有；測定340nm 吸光度下降速率，來計算ADH活性。
自備儀器和用品：
研缽、冰、低溫離心機、紫外分光光度計/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板、可調(diào)式移液器和蒸餾水。
試劑組成和配制：
試劑一：液體×1瓶，室溫保存。
試劑二：液體×1瓶，4℃保存。臨用前把試劑三轉(zhuǎn)移到試劑二中，4℃保存。
試劑三：粉劑×1瓶，－20℃保存。
試劑四：液體×1支，4℃保存。
粗酶液提取：
1、稱取約0.1g樣品，加試劑一1ml，冰上充分研磨，16000g 4℃離心20min，取上清待測。2、血清可以直接用于測定。
ADH測定操作：
1. 分光光度計預(yù)熱30 min，調(diào)節(jié)波長到340 nm，蒸餾水調(diào)零。
2. 試劑二在25℃水浴中保溫30 min以上。
3. 空白管：在微量石英比色皿/96孔板中依次加入20μL蒸餾水、160μL試劑二和20μL試劑四，迅速混勻后于340nm測定吸光值變化，分別記錄15s和75s時吸光值，分別記為A1和A2。△A空白管=A1-A2?？瞻坠苤恍枳?/span>1~2個。
4. 測定管：在微量石英比色皿/96孔板中依次加入20μL上清液、160μL試劑二和20μL試劑四，迅速混勻后于340nm測定吸光值變化，分別記錄15s和75s時吸光值，分別記為A3和A4。△A測定管=A3-A4。
ADH活性計算：
a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下
（1）按蛋白濃度計算
活性單位定義：25℃中每毫克蛋白每分鐘氧化1μmol NADH 為1U。
ADH (U/mg prot) =[(△A測定管–△A空白管)÷(ε×d)×V反總×106] ÷(Cpr×V樣)÷T
=1.61×(△A測定管–△A空白管) ÷Cpr
（2）按樣本鮮重計算
活性單位定義：25℃中每克樣品每分鐘氧化1μmol NADH 為1U。
ADH (U/g 鮮重) =[(△A測定管–△A空白管)÷(ε×d)×V反總×106] ÷(V樣÷V樣總×W)÷T
=1.61×(△A測定管–△A空白管) ÷W
ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×103L/mol/cm；d：比色皿光徑，1 cm；V反總：反應(yīng)體系總體積，200μL=2×10-4 L；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W ：樣品質(zhì)量；V樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，20μL=0.02 mL；V樣總：提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時間，1min。
b.使用96孔板測定的計算公式如下
（1）按蛋白濃度計算
活性單位定義：25℃中每毫克蛋白每分鐘氧化1μmol NADH 為1U。
ADH (U/mg prot) =[(△A測定管–△A空白管)÷(ε×d)×V反總×106] ÷(Cpr×V樣)÷T
=3.22×(△A測定管–△A空白管) ÷Cpr
（2）按樣本鮮重計算
活性單位定義：25℃中每克樣品每分鐘氧化1μmol NADH 為1U。
ADH (U/g 鮮重) =[(△A測定管–△A空白管)÷(ε×d)×V反總×106] ÷(V樣÷V樣總×W)÷T
=3.22×(△A測定管–△A空白管) ÷W
ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×103L/mol/cm；d：96孔板光徑，0.5 cm；V反總：反應(yīng)體系總體積，200μL=2×10-4 L；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W ：樣品質(zhì)量；V樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，20μL=0.02 mL；V樣總：提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時間，1min。
注意事項：
上清液蛋白質(zhì)濃度需要另外測定，建議使用本公司BCA蛋白質(zhì)含量測定試劑盒。
