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南京億迅生物科技有限公司
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脂肪酸合成酶（FAS）活性試劑盒
2019-11-19 閱讀(397)
| 提 供 商 | 南京億迅生物科技有限公司 | 資料大小 | 31.5KB |
|---|---|---|---|
| 資料圖片 | 下載次數(shù) | 47次 | |
| 資料類型 | WORD 文檔 | 瀏覽次數(shù) | 397次 |
測(cè)定意義：
FAS是脂肪酸合成關(guān)鍵酶，催化乙酰輔酶A和丙二酰輔酶A而生成長(zhǎng)鏈脂肪酸。FAS普遍表達(dá)于各種組織細(xì)胞中，在哺乳動(dòng)物肝、腎、腦、肺和乳腺以及脂肪組織中表達(dá)豐富。
測(cè)定原理：
FAS催化乙酰CoA、丙二酰CoA和NADPH生成長(zhǎng)鏈脂肪酸和NADP+；NADPH在340nm有吸收峰，而NADP+沒有；通過測(cè)定340nm 光吸收下降速率，計(jì)算FAS活性。
自備儀器和用品：
研缽、冰、臺(tái)式離心機(jī)、紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板、可調(diào)式移液槍和蒸餾水。
試劑組成和配制：
試劑一：液體×1瓶，－20℃保存。用前1d取出置于4℃充分解凍后混勻。
試劑二：粉劑×1瓶。臨用前加入440μL試劑四，充分溶解。
試劑三：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加入440μL試劑四，充分溶解。
試劑四：液體×1瓶, 4℃保存。
試劑五：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加入840μL試劑四，充分溶解。
粗酶液提取：
稱取約0.1g樣品，加試劑一1 mL充分研磨，16000rpm 4℃離心40min，取上清液，待測(cè)。
FAS測(cè)定操作：
1. 分光光度計(jì)預(yù)熱30min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到340 nm，蒸餾水調(diào)零。
2. 試劑四置于40℃水浴中預(yù)熱30 min以上。
3. 空白管：在500μL EP管中依次加入20μL蒸餾水、4μL試劑二、4μL試劑三、164μL試劑四和8μL試劑五，迅速混勻后于340nm處測(cè)定吸光值，記錄第30s和90s時(shí)吸光值，分別記錄為A1和A2。△A空=A1-A2。
4. 測(cè)定管：在500μL EP管中依次加入20μL上清液、4μL試劑二、4μL試劑三、164μL試劑四和8μL試劑五，迅速混勻后于340nm處測(cè)定吸光值，記錄第30s和90s時(shí)吸光值，分別記錄為A1和A2。△A測(cè)=A3-A4。
FAS活性計(jì)算：
a.使用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下
（1）按蛋白濃度計(jì)算
單位定義：37℃中每毫克蛋白每分鐘氧化1μmol NADPH 為1U。
FAS(U/mg prot) =[(△A測(cè)定管–△A空白管)÷(ε×d)×V反總×106] ÷(Cpr×V樣)÷T
=1.61×(△A測(cè)定管–△A空白管) ÷Cpr
（2）按樣本鮮重計(jì)算
單位定義：37℃中每克組織每分鐘氧化1μmol NADPH 為1U。
FAS(U/g 鮮重)= [(△A測(cè)定管–△A空白管)÷(ε×d)×V反總×106]÷(V樣÷V樣總×W) ÷T
=1.61×(△A測(cè)定管–△A空白管) ÷W
ε：NADPH摩爾消光系數(shù)，6.22×103L/mol/cm；d：比色皿光徑，1 cm；V反總：反應(yīng)體系總體積，200μL=2×10-4L；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W ：樣品質(zhì)量；V樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，20μL=0.02 mL；V樣總：提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，1min。
b.使用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下
（1）按蛋白濃度計(jì)算
單位定義：37℃中每毫克蛋白每分鐘氧化1μmol NADPH 為1U。
FAS(U/mg prot) =[(△A測(cè)定管–△A空白管)÷(ε×d)×V反總×106] ÷(Cpr×V樣)÷T
=3.22×(△A測(cè)定管–△A空白管) ÷Cpr
（2）按樣本鮮重計(jì)算
單位定義：37℃中每克組織每分鐘氧化1μmol NADPH 為1U。
FAS(U/g 鮮重)= [(△A測(cè)定管–△A空白管)÷(ε×d)×V反總×106]÷(V樣÷V樣總×W) ÷T
=3.22×(△A測(cè)定管–△A空白管) ÷W
ε：NADPH摩爾消光系數(shù)，6.22×103L/mol/cm；d：96孔板光徑，0.5 cm；V反總：反應(yīng)體系總體積，200μL=2×10-4L；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W ：樣品質(zhì)量；V樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，20μL=0.02 mL；V樣總：提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，1min。
注意事項(xiàng)：
上清液蛋白質(zhì)濃度需要另外測(cè)定，建議使用本公司BCA蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒。
