質(zhì)粒在非表達(dá)宿主菌中構(gòu)建完成后，通常轉(zhuǎn)化到一個帶有 T7 RNA 聚合酶基因的宿主菌（ λ DE3 溶原菌）中表達(dá)目標(biāo)蛋白。在 λ DE3 溶原菌中， T7 RNA 聚合酶基因由 lacUV5 啟動子控制。未誘導(dǎo)時便有一定程度轉(zhuǎn)錄，因此適合于表達(dá)其產(chǎn)物對宿主細(xì)胞生長無毒害作用的一些基因。而宿主菌帶有 pLysS 和 pLyE 時調(diào)控會更嚴(yán)緊。 pLys 質(zhì)粒編碼 T7 ，它是 T7 RNA 聚合酶的天然抑制物，因此可降低其在未誘導(dǎo)細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄目標(biāo)基因的能力。 pLysS 宿主菌產(chǎn)生低量 T7 ，而 pLysE 宿主菌產(chǎn)生更多酶，因此是zui嚴(yán)緊控制的 λ DE3 溶原菌。

有 11 種不同DE3 溶原化宿主菌。使用zui廣泛的為 BL21 及其衍生菌株，它的優(yōu)點(diǎn)在于缺失 lon 和 ompT 蛋白酶。 B834 菌株為營養(yǎng)缺陷型，因此可用 35 S- 和硒代對目標(biāo)蛋白進(jìn)行高特異活性標(biāo)記。 BLR 為 recA - 衍生菌株，改善了質(zhì)粒單體產(chǎn)量，有助于穩(wěn)定含有重復(fù)序列的目標(biāo)質(zhì)粒。兩個硫氧還蛋白還原酶（ trxB ）突變菌株（AD494,BL21 trxB ），有利于大腸桿菌胞漿中二硫鍵形成。 Origami TM 和 OrigamiB 菌株為 trxB/gor 雙突變，這兩個酶是主要還原途徑的關(guān)鍵酶。 Origami 和 OrigamiB 宿主菌的主要優(yōu)點(diǎn)是能形成正確折迭的含有二硫鍵的蛋白。新的 Rosetta TM 菌株補(bǔ)充了四種大腸桿菌稀有密碼子的 tRNA ，改善了由于密碼子使用頻率不同而引起的一些真核蛋白低表達(dá)。其它菌株背景包括 K-12 菌株 HMS174 和 NovaBlue ，象 BLR 一樣為 recA - 。這些菌株可穩(wěn)定表達(dá)其產(chǎn)物可能導(dǎo)致 DE3 噬菌體丟失的某些目標(biāo)基因。由于存在 F 附加體編碼的高親和力 lacIq 阻遏蛋白， NovaBlue 為一個有用的嚴(yán)緊型宿主菌。此外， Novagen 提供了 λ DE3 溶原化試劑盒，用于制備其它遺傳背景的新表達(dá)宿主菌。表達(dá)高毒性基因或制備新的 λ DE3 溶原菌的另一替代方法是通過 l CE6 感染提供 T7 RNA 聚合酶。雖然不如用 IPTG 誘導(dǎo) λ DE3 溶原菌方便，這種策略也被優(yōu)先用于一些應(yīng)用中。

高嚴(yán)緊性 T7 lac 啟動子

除了在宿主菌水平選擇三種基本的表達(dá)嚴(yán)緊性， pET 系統(tǒng)中 T7 啟動子本身提供了兩種不同的嚴(yán)緊性選擇：普通 T7 啟動子和 T7 lac 啟動子。 T7 lac 啟動子在啟動子區(qū)下游 17bp 處含有一個 25bp 的 lac 操縱序列。該位點(diǎn)結(jié)合 lac 阻遏蛋白能夠有效降低 T7 RNA 聚合酶的轉(zhuǎn)錄，這樣提供了在 λ DE3 溶原菌中抑制基礎(chǔ)表達(dá)的第二種基于 lacI 的機(jī)制（除了抑制 lacUV5 ）。含 T7 lac 啟動子的 pET 質(zhì)粒還具有它們自己的 lacI ，確保足夠的阻遏蛋白結(jié)合到操縱基因位點(diǎn)上。

在實(shí)際應(yīng)用中，為了獲得zui高產(chǎn)量的蛋白，通常應(yīng)該測試多種不同的載體 / 宿主菌組合。

控制誘導(dǎo)的表達(dá)水平

在許多情況下，表達(dá)活性可溶性的蛋白依賴于宿主細(xì)胞的背景、培養(yǎng)條件和合適的載體配置。通常，目標(biāo)蛋白活性zui高的條件與產(chǎn)量zui高的條件不一致。除了根據(jù)載體 / 宿主菌組合控制 T7 RNA 聚合酶的基礎(chǔ)表達(dá)提供不同嚴(yán)緊性， pET 系統(tǒng)還根據(jù)誘導(dǎo)物（ IPTG ）濃度，對目標(biāo)蛋白表達(dá)提供了真正的“變阻器”控制。 Tuner 和 OrigamiB 宿主菌的 lacY 突變使這種控制成為可能。

選擇 pET 載體

所有的 pET 載體均來自 pBR322 ，但彼此間先導(dǎo)序列、表達(dá)信號、融合標(biāo)簽、相關(guān)限制性位點(diǎn)和其它特點(diǎn)有所不同。有兩大類 pET 質(zhì)粒，即轉(zhuǎn)錄載體和翻譯載體：

轉(zhuǎn)錄載體（包括 pET-21 、 pET-23 和 pET-24 ）表達(dá)目標(biāo) RNA ，但不提供翻譯信號。它們用于從自身帶有細(xì)菌翻譯信號的目標(biāo)基因表達(dá)蛋白。（注意：轉(zhuǎn)錄載體通過命名后面的一個缺失字母后綴加以區(qū)分）

翻譯載體含有設(shè)計(jì)用于蛋白表達(dá)的有效翻譯起始信號。許多載體在讀碼框 a 、 b 和 c 中帶有克隆位點(diǎn)，分別對應(yīng)于 BamH I 位點(diǎn)的 GGA 、 GAT 和 ATC 三聯(lián)體。

選擇要點(diǎn)

選擇用于表達(dá)的 pET 載體通常涉及多種因素。考慮以下三個主要因素：

· 所表達(dá)蛋白的用途

· 所表達(dá)蛋白的已知信息

· 克隆策略

pET 載體表達(dá)的蛋白用途各種各樣。例如，表達(dá)量為分析級的蛋白可用于活性研究、突變體篩選和定性、篩選配體相互作用和抗原制備。大量活性蛋白用于結(jié)構(gòu)研究、試劑或親和基質(zhì)制備。許多載體適合表達(dá)用于篩選或抗原制備的分析量蛋白，然而只有載體、宿主菌和培養(yǎng)條件組合十分適宜才可能用于大量純化。如果需要活性蛋白連續(xù)高產(chǎn)，應(yīng)該試驗(yàn)多種載體、宿主菌和培養(yǎng)條件組合以找到*化結(jié)果。

任何關(guān)于目標(biāo)蛋白的已知信息都有助于載體選擇。例如，一些蛋白的活性要求一個或兩個末端沒有外源序列。許多 pET 載體能夠克隆非融合序列，然而如果特定翻譯起始序列不能在大腸桿菌中有效利用，表達(dá)水平可能受影響。在這些情況下，?？捎糜行П磉_(dá)的氨基末端序列構(gòu)建融合蛋白，然后在純化后用位點(diǎn)特異性蛋白酶消化去除融合序列。 LIC （連接非依賴的克隆）策略對這種方法特別有用，因?yàn)榭寺〔僮魍ㄟ^腸激酶和因子 Xa 能夠去除所有氨基端載體編碼序列。

由于限制性位點(diǎn)和讀碼框相容性的需要，克隆策略也會影響載體選擇。由于許多 pET 載體具有共同的限制性位點(diǎn)配置，通?？赡軐⒁淮沃苽涞哪繕?biāo)基因克隆到幾個載體中。采 PCR 克隆策略時則有不同的考慮。 LIC 載體試劑盒用于此目的，可通過 PCR 制備插入片段，而不需要限制性消化載體或插入片段。

溶解性和細(xì)胞定位

考慮了目標(biāo)蛋白的應(yīng)用和克隆策略，還應(yīng)該確定目標(biāo)蛋白的細(xì)胞定位和溶解性，這一點(diǎn)十分重要。在許多實(shí)際應(yīng)用中常希望表達(dá)可溶的活性蛋白。

特定目標(biāo)蛋白的溶解性取決于多種因素，包括各自的蛋白序列。在許多情況下，溶解性不是有或無的現(xiàn)象，載體、宿主菌和培養(yǎng)條件可被用來增加或減少獲得的可溶或不可溶形式的比例。 PET-32 載體系列使目標(biāo)序列與通常能夠增加可溶性蛋白比例的硫氧還蛋白（Trx.Tag ）融合。新推出的 pET-43.1 系列具有通過大量系統(tǒng)篩選而得到的一種過量表達(dá)時具有*溶解性的大腸桿菌蛋白 --Nus.Tag 融合伴侶，從而進(jìn)一步提高了目標(biāo)蛋白的可溶性。此外， trxB 突變株 AD494 和 BL21 trxB ，或 trxB/gor OrigamiTM 和 OrigamiB 菌株可用于在胞漿中形成許多真核蛋白正確折迭和活性所要求的二硫鍵。低溫誘導(dǎo)（ 15 -25 ° C ）也可增加可溶性目標(biāo)蛋白的比例。

獲得可溶性活性蛋白的另一策略是使蛋白外泌到胞外周質(zhì)中，為折迭和二硫鍵形成有更適宜的環(huán)境。為了達(dá)到這一目的，通常使用帶信號肽的載體。

一些純化策略可以優(yōu)化胞質(zhì)中不溶性包涵體的產(chǎn)量。抽提包涵體并溶解，然后目標(biāo)蛋白在體外重新折迭（如使用 Novagen 的蛋白折迭試劑盒）。該過程通常產(chǎn)生高產(chǎn)量初始蛋白并防止宿主細(xì)胞中的蛋白降解。然而，重新折迭成活性蛋白的效率隨不同蛋白變化很大，可能相當(dāng)?shù)汀?pET-31b （ + ）載體專為產(chǎn)生不可溶融合蛋白而設(shè)計(jì)，提供了生產(chǎn)小蛋白和多肽的有效方法。

滿足不同需要的融合標(biāo)簽

如果融合序列不影響應(yīng)用，生產(chǎn)帶有 S.Tag 、 T7.Tag a 、 His.Tag a 和 HSV.Tag a 的融合蛋白會很方便后續(xù)操作，并易于通過蛋白雜交檢測。這些多肽（融合序列很小），它們的檢測試劑極特異和靈敏。通過使用相應(yīng)樹脂和緩沖液試劑盒， GST.Tag 、 S.Tag 和 T7.Tag 序列可用于親和純化。

使用 S.Tag 和 GST.Tag 分析試劑盒可對粗提或純化的融合蛋白準(zhǔn)確定量。采用一種新穎底物的 FRETWorks S.Tag 分析試劑盒可通過熒光檢測到少于 1fmol 的融合蛋白。

His.Tag a 序列作為純化蛋白的融合伴侶非常有用，尤其對那些以包涵體形式表達(dá)的蛋白來說，它可以使親和純化可在溶解蛋白的*變性條件下進(jìn)行。

CBD.Tag a 在低費(fèi)用親和純化中非常有用。它們也特別適用于重新折迭（特別是帶有 CBD clos .Tag a 序列的 pET-34b （ + ）和 35b （ + ））。因?yàn)橹挥姓_重新折迭的 CBDs 結(jié)合到纖維素基質(zhì)上， CBIND 親和純化步驟能夠從制備物中去除不正確折迭的分子。任何標(biāo)簽可用于固定目標(biāo)蛋白，但由于 CBD.Tag 序列的低非特異性結(jié)合以及與纖維素基質(zhì)的生物相容性，使它更適合用于這一目的。

Nus.Tag 、 Trx.Tag 和 GST.Tag 序列用來增加其融合伴侶的溶解性。 Nus.Tag 和 Trx.Tag 載體與利于在胞漿中形成二硫鍵的 Origami 宿主菌相容。

各種融合標(biāo)簽和相應(yīng) pET 載體見列表。一些 pET 載體帶有數(shù)個***的融合標(biāo)簽，作為 5' 融合伴侶。此外，許多載體通過目標(biāo)基因序列符合讀碼框的通讀而表達(dá)末端帶有不同多肽標(biāo)簽的融合蛋白。使用在 5' 標(biāo)簽和目標(biāo)序列之間含有蛋白酶切割位點(diǎn)（、因子 Xa 和腸激酶）的載體，可以在純化后選擇性去除一個或多個標(biāo)簽。 pET-30 Ek/LIC 、 pET-32 Ek/LIC 、 pET-34 Ek/LIC 和 pET-36 Ek/LIC 是細(xì)胞定位和親和標(biāo)簽配置良好的代表。 pET Ek/LIC 載體 Combo 試劑盒包括所有 4 種即用型載體，可直接用于構(gòu)建數(shù)種目標(biāo)基因構(gòu)型。

pET NusA 融合系統(tǒng) 43.1

在大腸桿菌中生產(chǎn)可溶性活性蛋白

新推出的 pET NusA 融合系統(tǒng)設(shè)計(jì)用于克隆和高水平表達(dá)與 49a NusA （ Nus.Tag ）蛋白融合的多肽序列。對數(shù)據(jù)庫中 4000 個以上蛋白進(jìn)行可溶性建模， NusA 蛋白被確認(rèn)為具有zui高的可溶性。在用四種不同 NusA 融合蛋白進(jìn)行的試驗(yàn)中，大于 85% 的表達(dá)蛋白都是可溶的。 pET-43.1 載體含有 Nus.Tag 融合伴侶并與 trx/gor 突變體 Origami 和 OrigamiB 菌株相容，有利于在胞漿中形成二硫鍵。使用 pET-43.1 載體和這些 trx/gor 宿主菌組合可能獲得二硫鍵結(jié)合的蛋白。

優(yōu)點(diǎn)

· 高可溶性的 N- 末端 Nus.Tag 融合伴侶

· 上游 His.Tag a 、 S.Tag 和可選擇的 C- 末端 HSV.Tag a 、 His.Tag 融合標(biāo)簽

· 和腸激酶切割位點(diǎn)

· 多克隆位點(diǎn)位于所有讀碼框中

· 與 AD494 和 Origami 宿主菌株相容，可促進(jìn)表達(dá)蛋白的正確折迭

pET 宿主菌株感受態(tài)細(xì)胞

所有 pET 系統(tǒng)宿主菌以預(yù)測試的感受態(tài)細(xì)胞形式提供，可立即用于轉(zhuǎn)化。

（ DE3 ）指宿主為 λ DE3 溶原菌，其染色體上帶有一拷貝由 lacUV5 啟動子控制的 T7 RNA 聚合酶基因。這類菌株適用于從克隆到 pET 載體的目標(biāo)基因生產(chǎn)蛋白。命名為 pLysS 和 pLysE 的宿主菌帶有編碼 T7 （為 T7 RNA 聚合酶的天然抑制物）的 pET 相容性質(zhì)粒。帶有 pLysS 的細(xì)胞產(chǎn)生少量，而 pLysE 宿主菌產(chǎn)生更大量酶。這些菌株用于在誘導(dǎo)前抑制 T7 RNA 聚合酶的基礎(chǔ)表達(dá)，這樣可以穩(wěn)定編碼影響細(xì)胞生長和活力的目標(biāo)蛋白的 pET 重組體。帶有 pLacI 的宿主菌產(chǎn)生額外的抑制 pETBlue 和 pTriEx 載體基礎(chǔ)表達(dá)的 lac 阻遏蛋白。 λ DE3 溶原化試劑盒用于制備其它遺傳背景的新表達(dá)宿主菌。

AD494 菌株為硫氧還蛋白還原酶（ trxB ）突變菌株，能夠在胞漿內(nèi)形成二硫鍵，提供了生產(chǎn)正確折迭的活性蛋白的潛力。 TrxB 突變可用選擇，因此該菌株建議用于帶氨芐抗性標(biāo)記 bla 的質(zhì)粒。

B834 為 BL21 的親本菌株。這些蛋白酶缺陷宿主菌為營養(yǎng)缺陷型，可用 35 S- 和硒代對目標(biāo)蛋白進(jìn)行高特異活性標(biāo)記，從而用于結(jié)晶學(xué)研究。

BL21 應(yīng)用zui廣的宿主菌來源，具有 lon 和 ompT 蛋白酶缺陷的優(yōu)點(diǎn)。

BL21 TrxB 菌株在蛋白酶缺陷 BL21 背景上具有與 AD494 菌株相同的硫氧還蛋白還原酶突變（ trxB ）。由于 trxB 宿主有利于胞漿內(nèi)二硫鍵形成，它們的使用可增加正確折迭的蛋白組分。 TrxB 突變可用選擇，因此該菌株建議用于帶氨芐抗性標(biāo)記 bla 的質(zhì)粒。

BLR 為 BL21 的 recA - 衍生菌株，能夠改善質(zhì)粒單體產(chǎn)量，有助于穩(wěn)定含有重復(fù)序列或其產(chǎn)物能夠引起 DE3 噬菌體丟失的目標(biāo)質(zhì)粒。

HMS174 菌株在 K-12 背景上提供了 recA 突變。與 BLR 一樣，這些菌株能夠穩(wěn)定其產(chǎn)物能夠引起 DE3 噬菌體丟失的某些目標(biāo)基因。

NovaBlue 適合用作初始克隆宿主菌的 K-12 菌株，具有高轉(zhuǎn)化效率、藍(lán) / 白斑篩選能力（與合適質(zhì)粒）和導(dǎo)致質(zhì)粒 DNA 高產(chǎn)的 recA endA 突變。由于存在 F 附加體編碼的 lacI q 阻遏蛋白， NovaBlue 的 DE3 溶原菌是一個非常有用的嚴(yán)緊型宿主菌。

Origami 為 K-12 衍生的宿主菌，硫氧還蛋白還原酶突變（ trxB ）和還原酶（ gor ）基因均為突變，能夠大大增強(qiáng)胞漿內(nèi)二硫鍵的形成。研究表明即使總體表達(dá)水平相似， Origami （ DE3 ）表達(dá)的活性蛋白比其它宿主菌高 10 倍以上。 Origami 宿主菌與氨芐抗性質(zhì)粒相容，可用于 pET-32 載體，硫氧還蛋白標(biāo)簽?zāi)軌蜻M(jìn)一步增強(qiáng)在胞漿內(nèi)形成二硫鍵。 TrxB 和 gor 突變可分別用和四環(huán)素選擇，因此該菌株建議用于帶氨芐抗性標(biāo)記 bla 的 pET 質(zhì)粒。

Origami B 宿主菌來源于 BL21 lacZY 突變株，還帶有與原始 Origami 菌株相同的 TrxB / gor 突變。 Origami B 菌株集 BL21 、 Tuner 和 Origami 宿主菌的優(yōu)點(diǎn)于一體。 TrxB 和 gor 突變可分別用和四環(huán)素選擇，因此該菌株建議用于帶氨芐抗性標(biāo)記 bla 的 pET 質(zhì)粒。

Rosetta 宿主菌從 BL21 衍生而來，可增強(qiáng)帶有大腸桿菌稀有密碼子的真核蛋白的表達(dá)。該菌株通過一個相容性抗性質(zhì)粒補(bǔ)充密碼子 AUA 、 AGG 、 AGA 、 CUA 、 CCC 和 GGA 的 tRNAs 。這樣 Rosetta 菌株提供了“”的翻譯，從而避免因大腸桿菌密碼子使用頻率導(dǎo)致的表達(dá)限制。 tRNA 基因由它們的天然啟動子驅(qū)動。在 Rosetta （ DE3 ） pLysS 和 Rosetta （ DE3 ） pLacI 中，稀有 tRNA 基因存在于分別帶有 T7 和 lac 阻遏基因的同一質(zhì)粒上。

Tuner 菌株為 BL21 的 lacZY 缺失突變株，能夠調(diào)整培養(yǎng)物中所有細(xì)胞的蛋白表達(dá)水平。 lac 通透酶（ lacY ）突變使得 IPTG 均勻進(jìn)入群體所有細(xì)胞，從而具有濃度依賴、水平均一的誘導(dǎo)表達(dá)。通過調(diào)整 IPTG 濃度，表達(dá)可從極低水平調(diào)節(jié)到*、*誘導(dǎo)的表達(dá)水平（通常與 pET 載體相關(guān)）。低水平表達(dá)有時可能增強(qiáng)難表達(dá)蛋白的溶解性和活性。 Tuner （ DE3 ） pLacI 菌株與 pETBlue 和 pTriEx 載體的表達(dá)相容。

建議兄弟首先學(xué)習(xí)本版以前的帖子。

搬出老帖子，我們共同學(xué)習(xí)一下：

eeflying

：原核表達(dá)系統(tǒng)中，哪種載體 ?

原核表達(dá)沒有，可以說一般都是在碰，

和你要表達(dá)蛋白的性質(zhì)有關(guān)，也和你表達(dá)后的用途，及因此而選擇的表達(dá)策略有關(guān)。

比如，

1。你是否介意有親和標(biāo)簽，親和純化當(dāng)然純化相對容易，但有時親和標(biāo)簽的存在會影響蛋白的功能，

2。如果用親和標(biāo)簽，用什么親和純化策略，his 或GSH還是染料抑或是IgG-ProteinA親和，LAB的IMPAC-TWIN,還是別的如轉(zhuǎn)鐵蛋白等，親和層析的策略也有很多，

3。zui終產(chǎn)物是否有必要將親和標(biāo)簽去掉，如用蛋白酶切掉標(biāo)簽，或 IMPAC-TWIN會自己切掉，用因子X切掉HIS,

4。表達(dá)的部位，是可溶性表達(dá)還是包涵體表達(dá)，是周質(zhì)表達(dá)還是分泌表達(dá)還是分泌表達(dá)。

5。是否加入開關(guān)誘導(dǎo)、或是加入IPTG誘導(dǎo)噬菌體T7系統(tǒng)。

6。你表達(dá)的蛋白質(zhì)是否會與細(xì)菌內(nèi)某些蛋白相互作用而致表達(dá)失敗。

7。如果不用親和標(biāo)簽，純化用什么方法純化?

8。即使都考慮全了，表達(dá)也未必成功，換載體是很常見的是。

9。載體選好后，表達(dá)條件的優(yōu)化，如培養(yǎng)溫度，培養(yǎng)時間，IPTG濃度等，我們一般在這部用正交設(shè)計(jì)或析因設(shè)計(jì)決定。

10。蛋白純化條件的優(yōu)化，用均勻設(shè)計(jì)或球面設(shè)計(jì)或正交設(shè)計(jì)作曲線擬合，通過導(dǎo)數(shù)求極值的方法優(yōu)化蛋白純化條件。

這些問題是相互關(guān)聯(lián)的，在實(shí)踐中可得有一段時間去摸索了。

YONG

:原核表達(dá)系統(tǒng)中，哪種載體 ?

載體沒有，看哪一種zui合適你的實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/p>

這幾年新發(fā)展的載體一般具有下列特點(diǎn)的一個或多個：

1）更多的融合標(biāo)簽選擇（提供多種親和純化方便）

2）嚴(yán)緊的表達(dá)調(diào)控，更低的滲漏表達(dá)

3）分子伴侶蛋白，促進(jìn)折疊和可溶性表達(dá)

此外，具有更好的質(zhì)粒穩(wěn)定性并能夠糾正遺傳密碼偏愛的新的蛋白酶缺陷的宿主細(xì)胞也是一個很好的工具。

的不一定是的，pBV220經(jīng)常可以給出不錯的表達(dá)，雖然多半是包含體。

YONG

:關(guān)于表達(dá)載體

不同的載體的特點(diǎn)不同，主要的差別有啟動子類型，質(zhì)?？截悢?shù)等，基因本身的因素基因5’非編碼區(qū)的二極結(jié)構(gòu)，密碼子的偏愛性等，宿主菌的特點(diǎn)也很重要（BL21是蛋白酶缺陷的菌株），融合表達(dá)策略也有利于順利表達(dá)外源蛋白。這些就決定了對某一個特定的基因而言，并非所有的表達(dá)載體都適合。現(xiàn)在還沒有誰可以用大腸桿菌成功表達(dá)每一個基因，尤其是使用的表達(dá)系統(tǒng)更是不可能。根據(jù)研究的目的以及基因和載體的特點(diǎn)選擇表達(dá)系統(tǒng)，說說容易，做起來很難。

SDS-PAGE所顯示的不表達(dá)很多情況下是低表達(dá)，尤其是當(dāng)目的蛋白遷移率與菌體中某種豐富蛋白一致時，不高的表達(dá)帶常被遮蓋。Western blotting的靈敏度高，可以用來檢測很低的表達(dá)。

對于某些研究來說，表達(dá)是為了在細(xì)胞內(nèi)提供某種功能，不需要高表達(dá);更多的情況是把大腸桿菌作為制備重組蛋白的細(xì)胞工廠，此時表達(dá)量具有重要意義，低表達(dá)為蛋白純化帶來困難，對于某些研究或開發(fā)來說，低表達(dá)意義不大。當(dāng)然，通過western blotting檢測可以排除一些基因表達(dá)中的不確定或待確定因素，而且某些時候即使是高表達(dá)，western blotting也是蛋白定性的重要指標(biāo)。

YONG

:請教-pET表達(dá)

我試著說一下：

1）如何獲得非融合表達(dá)?

的非融合表達(dá)很多情況下是大腸桿菌表達(dá)zui愿意看到的結(jié)果，如果是可溶性的，可能會讓大部分研究者更加興奮。但理想和現(xiàn)實(shí)是有差距的。憑心而論，你做的還是不錯的，畢竟看到了表達(dá)，雖然是包含體，雖然信號肽的切割情況不明，畢竟你可以拿到東西了。可以試一下包含體的復(fù)性和純化，測測活吧!否定一個信心苦苦得出的結(jié)果要慎重呀!

下面討論一下如何實(shí)現(xiàn)更高的追求：

首先是老生長談，影響大腸桿菌表達(dá)的因素：

遺傳密碼偏愛性、mRNA5'二級結(jié)構(gòu)、第二密碼子等，參見各種綜述和論壇中的帖子。

融合表達(dá)優(yōu)化了上述影響表達(dá)的因素，所以更容易成功。很多藥用蛋白的表達(dá)也采用了融合表達(dá)策略，可能是無奈的選擇，也可能是為了獲得可溶性表達(dá)或?yàn)榱双@得有利于初步純化的性質(zhì)并成功的解決了酶切或化學(xué)切割融合頭后目的蛋白的純化。IL-11就是這樣的例子。所以非融合表達(dá)并不是一無是處，關(guān)鍵看有沒有辦法達(dá)到zui后的目的。如果是藥用蛋白，準(zhǔn)備申報(bào)臨床，保持天然的N-末端，所以蛋白酶或化學(xué)切割要非常特異，不要再N端引入新的氨基酸或?qū)е履康牡鞍譔端不整齊。

非融合表達(dá)的N端的Met一般是報(bào)批容許的，雖然這不是天然的形式。非融合表達(dá)省略了切割融合頭的步驟和切割后的純化步驟，具有成本優(yōu)勢。非融合表達(dá)的實(shí)現(xiàn)首先需要分析，其次看運(yùn)氣，有時運(yùn)氣因素更多。盡可能把影響基因表達(dá)的因素都考慮到并逐個優(yōu)化要花費(fèi)很大的精力，但這并不能保證這種優(yōu)化一定會得到理想的結(jié)果，未知的因素和因素之間的作用使得的優(yōu)化方案非常難實(shí)現(xiàn)，而且基因本身的因素也不允許隨心所欲的優(yōu)化（比如氨基酸序列不能任意改變）。原核表達(dá)的特點(diǎn)就是時間短、花錢少，所以多方案的嘗試和理性的分析結(jié)合是大多數(shù)研究者采用的基本策略。具體到你的實(shí)驗(yàn)來說，如果你是要做藥用蛋白，在融合表達(dá)成功后可以a.純化一點(diǎn)蛋白，看看N-末端;b.在你的融合頭后面引入一個切割位點(diǎn)，切割后產(chǎn)生天然N-末端。選擇策略看你們實(shí)驗(yàn)室的傳統(tǒng)，怎么方便怎么做。有的實(shí)驗(yàn)室純化能力強(qiáng)，有得上游強(qiáng)。不管如何，建立有效的測活方法很關(guān)鍵，這可以為表達(dá)策略和純化策略提供指引。

至于可溶性表達(dá)，看情況吧!如果你的包含體復(fù)性很成功，不必強(qiáng)求可溶性。降低誘導(dǎo)溫度，降低菌生長速度和基因表達(dá)速度，降低總表達(dá)量，把蛋白導(dǎo)入周質(zhì)空間和使用具有分子伴侶功能的融合等策略有助于實(shí)現(xiàn)可溶性表達(dá)，但都沒有把握。如果你的蛋白的二硫鍵非常多，可溶性表達(dá)難度會較大。這些一般的原則很多綜述或研究論文都有不同角度的表述，關(guān)鍵是結(jié)合自己的研究目的和實(shí)驗(yàn)室的條件靈活運(yùn)用。

2）基因往表達(dá)載體中克隆失敗?？赡苁强寺〉牟僮鲉栴}，也可能是這種表達(dá)方式導(dǎo)致的表達(dá)對細(xì)胞生長有不利影響或重組后的質(zhì)粒不穩(wěn)定。

驗(yàn)證克隆操作可以通過載體自連對照解決，如果載體自連后的轉(zhuǎn)化子沒有或很少，說明酶切操作沒有問題。

如果表達(dá)產(chǎn)物對細(xì)胞有毒或質(zhì)粒不穩(wěn)定就不容易解決了，也許憑經(jīng)驗(yàn)可以判斷原因，但更換載體、宿主或表達(dá)方式可能是zui常用的方法。

YONG

:淺論基因表達(dá)系統(tǒng)的選擇

因表達(dá)是基因工程的重要內(nèi)容，是工業(yè)、醫(yī)療和基礎(chǔ)研究領(lǐng)域的重要技術(shù)。

基因表達(dá)系統(tǒng)按照基因表達(dá)宿主的性質(zhì)分為原核表達(dá)系統(tǒng)和真核表達(dá)系統(tǒng)兩類，前者主要包括大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)和枯草桿菌表達(dá)系統(tǒng)等，后者主要包括酵母表達(dá)系統(tǒng)、絲狀真菌表達(dá)系統(tǒng)和哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)等。

原核表達(dá)系統(tǒng)以大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)為代表，具有遺傳背景清楚、成本低、表達(dá)量高和表達(dá)產(chǎn)物分離純化相對簡單等優(yōu)點(diǎn)，缺點(diǎn)主要是蛋白質(zhì)翻譯后加工機(jī)制的缺乏，如二硫鍵的形成、蛋白糖基化和正確折疊。

簡單單細(xì)胞真核生物表達(dá)系統(tǒng)以酵母表達(dá)系統(tǒng)為代表，其中甲醇酵母具有較大優(yōu)勢（主要包括畢赤酵母Pichia pastoris和漢森酵母Hansenula ploymorpha）。甲醇酵母表達(dá)系統(tǒng)主要優(yōu)點(diǎn)有：表達(dá)量高，表達(dá)可誘導(dǎo)，糖基化機(jī)制接近高等真核生物，分泌蛋白易純化，容易實(shí)現(xiàn)高密發(fā)酵等。缺點(diǎn)是并非所有基因都可以獲得高表達(dá)，當(dāng)然，這是幾乎所有表達(dá)系統(tǒng)的共同問題。

哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)主要優(yōu)點(diǎn)是蛋白翻譯后加工機(jī)制zui接近體內(nèi)的天然形式，缺點(diǎn)是表達(dá)量通常較低，生產(chǎn)成本高。

表達(dá)系統(tǒng)選擇的根據(jù)是研究和開發(fā)的目的。具體考慮以下幾個方面：

目的基因的來源，如果是大腸桿菌來源的基因，選擇大腸桿菌作為表達(dá)系統(tǒng)較好，這主要是考慮到與目的基因來源相同的宿主對于保證蛋白的活性較有利且基因遺傳密碼的偏愛性較一致。

生產(chǎn)的成本和工藝放大要求。大腸桿菌和畢赤酵母系統(tǒng)生產(chǎn)重組蛋白的成本低，生產(chǎn)工藝較簡單，用于規(guī)?；a(chǎn)較有利。如果是研究需要小量蛋白，主要考慮目的蛋白的活性和小規(guī)模純化制備的方便。

研究周期和可操作性。在這一點(diǎn)上，大腸桿菌優(yōu)于酵母，酵母優(yōu)于細(xì)胞。

蛋白的用途和用量。對于藥品開發(fā)，這三種宿主都可以選擇，但要考慮到報(bào)批的要求。如果是體內(nèi)用，天然的氨基酸序列較重要，不要因?yàn)榛虮磉_(dá)和蛋白純化的便利引入融合伴侶，如果是制備抗原用于純化和體外的活性研究則不必太嚴(yán)格。某些蛋白體內(nèi)活性需要的劑量并不大，如angiostatin，但是，大腸桿菌或酵母表達(dá)的蛋白體內(nèi)半衰期短，所以蛋白用量較大。

蛋白的天然性質(zhì)。如果目的蛋白本身是分泌蛋白，則選擇分泌表達(dá)較好，畢赤酵母分泌表達(dá)優(yōu)勢非常顯著。對于大腸桿菌系統(tǒng)來說，其蛋白的分泌機(jī)制復(fù)雜，除了信號肽之外，有些蛋白的分泌和與成熟蛋白的序列有關(guān)，而且大腸桿菌的分泌很難進(jìn)入培養(yǎng)基，通常是在周質(zhì)空間積累。根據(jù)蛋白活性的要求，結(jié)合其天然的性質(zhì)，選擇表達(dá)系統(tǒng)是非常重要的。

知識產(chǎn)權(quán)的考慮。如果是研究工作，選擇商品化的載體較好，因?yàn)橥袑@些載體也很了解，對于用這些載體做出來的結(jié)果容易比較。如果是開發(fā)工作，選擇表達(dá)系統(tǒng)時是把載體的知識產(chǎn)權(quán)問題考慮進(jìn)去，否則可能會受制于人。

總之，選擇一種合適的表達(dá)系統(tǒng)是開始基因表達(dá)工作前的重要步驟，選擇的主要依據(jù)是研究的目的，結(jié)合各種其他參數(shù)的綜合考慮。這種選擇可以充分體現(xiàn)出研究者智慧和風(fēng)格。

YONG

:尋找載體

1）pThioHisA,B,C

Trc 啟動子，Thioredoxin融合，IPTG誘導(dǎo)，也可以用NdeI進(jìn)行非融合表達(dá)

www.invitrogen.com

2）pBV220

PLPR***啟動子，42度熱誘導(dǎo)，EcoRI克隆，非融合表達(dá)。

病毒所張智清、候云德等構(gòu)建，國內(nèi)很多實(shí)驗(yàn)室有。

3）pET系列

T7啟動子，IPTG誘導(dǎo)，一般為融合表達(dá)，NdeI或NcoI非融合表達(dá)

www.novagen.com

4）pQE系列載體

T5啟動子,IPTG誘導(dǎo)，融合表達(dá)

www.qiagen.com

原核表達(dá)載體種類非常多，下表不一定全

Features of E.coli Expression Vectors

Vector Name Promoter Selection marker Tag or Fusion Partener Protease Cleavage Replicon Provider

pALTER-Ex1 T7 Tet none none Promega

pALTER-Ex2 T7 Tet none none Promega

pBAD/His araBAD Amp N-His EK pUC Invitrogen

pBAD/Myc-His araBAD Amp C-His none pUC Invitrogen

pBAD/gIII araBAD Amp C-His none ColE1 Invitrogen

pCal-n T7-lac Amp N-CBP Thr ColE1 Stratagene

pCal-n-EK T7-lac Amp N-CBP Thr，EK ColE1 Stratagene

pCal-c T7-lac Amp C-CBP Thr ColE1 Stratagene

pCal-Kc T7-lac Amp C-CBP Thr ColE1 Stratagene

pcDNA 2.1 T7 Amp none none pUC Invitrogen

pDUAL T7-lac Kan C-CBP Thr ColE1 Stratagene

pET-3a-c T7 Amp none none pBR322 Novagen

pET-9a-d T7 Kan none none pBR322 Novagen

pET-11a-d T7-lac Amp none none pBR322 Novagen

pET-12a-c T7 Amp none none pBR322 Novagen

pET-14b T7 Amp N-His Thr pBR322 Novagen

pET-15b T7-lac Amp N-His Thr pBR322 Novagen

pET-16b T7-lac Amp N-His Xa pBR322 Novagen

pET-17b T7 Amp none none pBR322 Novagen

pET-19b T7-lac Amp N-His EK pBR322 Novagen

pET-20b（+） T7 Amp signal sequence C-His none pBR322 Novagen

pET-21a-d（+） T7-lac Amp C-His none pBR322 Novagen

pET-22b（+） T7-lac Amp signal sequence C-His none pBR322 Novagen

pET-23a-d（+） T7 Amp C-His none pBR322 Novagen

pET-24a-d（+） T7-lac Kan C-His none pBR322 Novagen

pET-25b（+） T7-lac Amp signal sequence C-His none pBR322 Novagen

pET-26b（+） T7-lac Kan Signal sequence C-His none pBR322 Novagen

pET-27b（+） T7-lac Kan signal sequence C-His none pBR322 Novagen

pET-28a-c（+） T7-lac Kan N-His C-His Thr pBR322 Novagen

pET-29a-c（+） T7-lac Kan C-His Thr pBR322 Novagen

pET-30a-c（+） T7-lac Kan N-His C-His Thr EK pBR322 Novagen

pET-31b（+） T7-lac Amp C-His none pBR322 Novagen

pET-32a-c（+） T7-lac Amp internal His C-His Thr EK pBR322 Novagen

pET-33b（+） T7-lac Kan internal His C-His Thr EK pBR322 Novagen

pET-34b（+） T7-lac Kan N-CBDclos C-His Thr EK pBR322 Novagen

pET-35b（+） T7-lac Kan N-CBDclos C-His Thr Xa pBR322 Novagen

pET-36b（+） T7-lac Kan signal sequence N-CBDcenA C-His Thr EK pBR322 Novagen

pET-37b（+） T7-lac Kan signal sequence N-CBDcenA C-His Thr Xa pBR322 Novagen

pET-38b（+） T7-lac Kan signal sequence C-CBDcex C-His Thr pBR322 Novagen

pET-39b（+） T7-lac Kan （signal sequence） DsbA N-His C-His Thr EK pBR322 Novagen

pET-40b（+） T7-lac Kan （signal sequence） DsbC N-His C-His Thr EK pBR322 Novagen

pET-41a-c（+） T7-lac Kan GST N-His C-His Thr EK pBR322 Novagen

pET-42a-c（+） T7-lac Kan GST N-His C-His Thr Xa pBR322 Novagen

pET-43a-c（+） T7-lac Kan NusA C-His N-His Thr EK pBR322 Novagen

pETBlue-1 T7-lac Amp C-His none pUC Novagen

pETBlue-2 T7-lac Amp C-His none pUC Novagen

pETBlue-3 T7-lac Amp N-His C-His Thr EK pUC Novagen

pGEMEX-1 T7 Amp T7 gene 10 none Promega

pGEMEX-2 T7 Amp T7 gene 10 none Promega

pGEX-1lT tac Amp GST Thr pBR322 Pharmacia

pGEX-2T tac Amp GST Thr pBR322 Pharmacia

pGEX-2TK tac Amp GST Thr EK pBR322 Pharmacia

pGEX-3X tac Amp GST Xa pBR322 Pharmacia

pGEX-4T tac Amp GST Thr pBR322 Pharmacia

pGEX-5X tac Amp GST Xa pBR322 Pharmacia

pGEX-6P tac Amp GST Pre pBR322 Pharmacia

pHAT10/11/12 lac Amp N-HAT EK pUC Clontech

pHAT20 lac Amp N-HAT EK pUC Clontech

pHAT-GFPuv lac Amp N-GFPuv EK pUC Clontech

pKK223-3 tac Amp none none pBR322 Pharmacia

pLEX PL Amp none none pUC Invitrogen

pMAL-c2X tac Amp N-MBP Xa ColE1 NEB

pMAL-c2E tac Amp N-MBP EK ColE1 NEB

pMAL-c2G tac Amp N-MBP Gen ColE1 NEB

pMAL-p2X tac Amp N-MBP Xa ColE1 NEB

pMAL-p2E tac Amp N-MBP EK ColE1 NEB

pMAL-p2G tac Amp N-MBP Gen ColE1 NEB

pProEX HT trc Amp N-His TEV Life Technologies

pPROLar.A lac-ara1 Kan N-c-Myc EK p1 Clontech

pPROTet.E LtetO-1 Cam N-c-Myc EK ColE1 Clontech

pQE-9 T5-lac Amp N-His none ColE1 Qiagen

pQE-16 T5-lac Amp C-His none ColE1 Qiagen

pQE-30/31/32 T5-lac Amp N-His none ColE1 Qiagen

pQE-40 T5-lac Amp N-His N-DHFR none ColE1 Qiagen

pQE-60 T5-lac Amp C-His none ColE1 Qiagen

pQE-70 T5-lac Amp C-His none ColE1 Qiagen

pQE-80/81/82L T5-lac Amp N-His none ColE1 Qiagen

pQE-100 T5-lac Amp N-His none ColE1 Qiagen

pRSET T7 Amp N-His EK ColE1 Invitrogen

pSE280 trc Amp none none pUC Invitrogen

pSE380 trc Amp none none pUC Invitrogen

pSE420 trc Amp none none pUC Invitrogen

pThioHis trc Amp His-Patch EK Trx ColE1 Invitrogen

pTrc99A trc Amp none none pBR322 Pharmacia

pTrcHis trc Amp N-His EK pUC Invitrogen

pTrcHis2 trc Amp C-His none pUC Invitrogen

pTriEx-1 T7 Amp C-His none pUC Novagen

pTriEx-2 T7-lac Amp N-His C-His Thr EK pUC Novagen

pTrxFus PL Amp Trx EK ColE1 Invitrogen

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士鋒生物原核蛋白表達(dá)載體的討論

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