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士鋒生物畢赤酵母蛋白不表達(dá)的原因

時間:2013/8/30閱讀:1480
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 1、誘導(dǎo)之后表達(dá)上清中檢測不到目的蛋白:

分析1:檢測的方法是否有問題,要考慮是不是蛋白表達(dá)量低而沒有檢測到?

如果是蛋白表達(dá)低,可以選擇濃縮蛋白,具體的方法很多,有TCA、丙酮、濃縮柱等等方法,之前在本版已經(jīng)發(fā)過帖,在此不贅述。

2、如果蛋白濃縮N倍之后仍然檢測不到,那基本可以確證蛋白并不在上清中。那么蛋白到哪里去了,考慮是否沒有分泌出來,而是在胞內(nèi),那就需要通過裂解酵母來檢測胞內(nèi)蛋白,具體的方法很多,在此也不贅述,曾整理過相關(guān)破碎的帖子。

3、如果胞內(nèi)也沒有目的蛋白表達(dá),那么基本可以確定蛋白并沒有表達(dá)。

4、為什么沒有表達(dá)呢?倒推回來就是誘導(dǎo)的過程了,誘導(dǎo)體系是什么?甲醇濃度是多少?培養(yǎng)問題是多少,轉(zhuǎn)速是多少?這些都要注意。甲醇一般是0.5%-1.0%,本人用的是0.5%,也有很多人也用1.0%,曾見過一個帖子,說超過1.5%反而會抑制表達(dá),沒有驗(yàn)證過,供大家參考。培養(yǎng)問題28-30度比較合適,轉(zhuǎn)速250rpm比較合適,誘導(dǎo)體系沒有固定的體系,說明書上的是BMGYOD600 2~6,換到BMMYOD600 1左右。

5、如果誘導(dǎo)的過程也沒有問題,那問題就復(fù)雜了,特別是重組酵母PCR檢測證明目的基因確實(shí)已經(jīng)發(fā)生了重組。這個時候是zui郁悶的了,但是郁悶怎么辦,還是要找原因,在此我給的建議是先做RT-PCR證明mRNA水平的情況,也就是說有沒有轉(zhuǎn)錄。如果轉(zhuǎn)錄了,后續(xù)的操作也沒有問題本帖的1、2、3、4項(xiàng),那么只有重新設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn),比如換酵母株,有文章上說:用GS115表達(dá)不出蛋白,換KM71H后,大部分克隆能表達(dá)。

6、有個帖子說的很好,在此和大家分享一下。

1、 菌株:用GS115表達(dá)不出蛋白,換KM71H后,大部分克隆能表達(dá)。

2、溫度: 在28度和室溫下誘導(dǎo)表達(dá),表達(dá)水平可能都不低。

3、pH:手冊上用6.0,pH提高到6.8,不表達(dá)的蛋白可能就表達(dá)出來。BMMYpH7.0-7.5比較合適。國內(nèi)外做的的rHSA,zui適pH大概5-6左右。pH3的時候yeastpeptone好像會沉淀的,可以用磷酸和磷酸二氫鉀調(diào),具體比例自己去試試。

4、偏愛密碼子: codon bias一般不是主要的問題,你要表達(dá)的蛋白特性才是主要問題,酵母對分子量大(30KD以上,結(jié)構(gòu)復(fù)雜如一些蛋白酶,二硫鍵含量多的蛋白往往不能有效表達(dá),尤其是分泌表達(dá)。密碼子改造對一些較小的而且結(jié)構(gòu)簡單的蛋白表達(dá)量的提高可能有一些作用。比如一位戰(zhàn)友用Pichia酵母表達(dá)一個單鏈抗體,29KD,含有2對二硫鍵,表達(dá)量約幾毫克每升,選用酵母偏好密碼子全基因合成后,表達(dá)量沒有什么提高。

5、表達(dá)時間與空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化對照:誘導(dǎo)時間長了以后,是會有很多蛋白分泌出來的,時間越長雜蛋白就越多,且分子量都比較大。做一個空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的對照,這樣就會比較肯定到底是不是自身的蛋白分泌的結(jié)果。

6、污染:每個樣品從G418板上挑10個左右單克隆于2ml BMGY搖菌(30ml玻璃管,比LB管大一點(diǎn),紗布一般用8層,一天左右看著比較渾離心,留樣1ml,余1ml2ml BMMY誘導(dǎo)表達(dá),3,4層紗布足夠了。

污染一般都是跟瓶口覆蓋有關(guān)的原因造成的,只蓋紗布肯定會污染。加蓋報紙后,就再沒遇到過污染。如果只用6層紗布,污染的可能當(dāng)然很大,100ml三角瓶,裝量10ml培養(yǎng)液,用橡筋把8層紗布和2層報紙拴緊封口,空氣浴搖床。

7、不表達(dá):蛋白有沒有表達(dá)就要看你的運(yùn)氣了,一般重復(fù)2-3次實(shí)驗(yàn)都沒有表達(dá)菌株,這個蛋白就放棄表達(dá)了。

8、表達(dá)量: 30KD,10mg/L表達(dá)量已經(jīng)很高,zui直接的方法是發(fā)酵,一般提高5-10倍。大腸桿菌一樣出現(xiàn)大團(tuán)的超表達(dá)蛋白。

9、糖基化:酵母分泌表達(dá)的N糖基化是可以預(yù)測的,有如下序列:N X S/T就是潛在的糖基化位點(diǎn),X為任意氨基酸,1個糖基化位點(diǎn)會加上1-3KD左右的糖基。另外可能還有O糖基化話,但是無法預(yù)測其位點(diǎn),不過很少聽說表達(dá)蛋白有O糖基化的。如果胞內(nèi)表達(dá),不存在糖基化的問題。

10、表型與表達(dá):重組SalIBglII酶切產(chǎn)生單交換和雙交換,結(jié)果就是產(chǎn)生Mut+Muts表型的菌株;前者在甲醇誘導(dǎo)表達(dá)時生長快,消耗的甲醇多,后者生長慢,消耗的甲醇少,所以誘導(dǎo)表達(dá)時Muts表型要求更高的菌體濃度。一般用Mut+表型的較多,但是對某些蛋白Muts菌株可能表達(dá)的更好,只有試試才知道你的蛋白用那種菌株表達(dá)較好。

11、培養(yǎng)基

YPD:zui基本的培養(yǎng)用;BMGY:誘導(dǎo)表達(dá)前培養(yǎng)用;BMMY:誘導(dǎo)表達(dá)用;MD:電轉(zhuǎn)化后篩選his+用。

YEPD是不能代替BMGY的,因?yàn)橛衅咸烟?,這樣殘留的葡萄糖會影響下一步的誘導(dǎo)表達(dá)。不過有一種方法是可行的,就是用YPG培養(yǎng)基代替,只是把YEPD中的葡萄糖用3%的甘代替,也可以降低成本。搖瓶畢竟不能和發(fā)酵罐比,油殘余會抑制甲醇利用。

BMGY、BMMY滅菌后才能加甲醇、磷酸鉀、。配制BMMY時也沒必要用5%過濾除菌的甲醇,在滅菌后使用前加甲醇至你要的濃度。

YNB可以高壓滅菌,沒問題的,也可以0.22um過濾處理,天冬氨酸和要待培養(yǎng)基高壓滅菌后加入;YPD時可以加入YPD一起滅菌,但時間不能太長,溫度不能太高,一般121-12512-15分鐘足夠了。若時間過長,溫度過高,可能導(dǎo)致YPD焦化。glucose和含氮化合物在一起容易產(chǎn)生美拉德反應(yīng),這是配制培養(yǎng)基中的禁忌。顏色很深的話,基本不能使用了。或者含有葡萄糖和/YNB的培養(yǎng)基10835min高壓滅菌。

小量發(fā)酵其實(shí)可以把培養(yǎng)基成分中的YNB和去除,培養(yǎng)基價格便宜,操作又方便,可以直接滅菌,效果也很好效果不比含YNB的差。

如果是用自己配置的培養(yǎng)基,如玉米浸提液、麥芽浸提液、麥麩浸提液等等,可以不用換液,采取添料來維持酵母對培養(yǎng)基的營養(yǎng)需要。

用無機(jī)鹽進(jìn)行大規(guī)模發(fā)酵,更省錢。

 

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