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上海士鋒生物科技有限公司
中級(jí)會(huì)員 | 第14年

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標(biāo)準(zhǔn)品
培養(yǎng)基
培養(yǎng)基原料 霍亂弧菌診斷血清 大腸艾希氏菌診斷血清 志賀氏菌屬診斷血清 沙門氏菌屬診斷血清 標(biāo)準(zhǔn)血清,診斷血清 抗生素藥敏紙片 微生物配套試劑 微生物生化管 管裝培養(yǎng)基 即用型液體培養(yǎng)基 一次性培養(yǎng)基平板 顯色培養(yǎng)基 臨床培養(yǎng)基 菌種保存培養(yǎng)基 四環(huán)素檢定、厭氧亞硫酸鹽還原桿菌檢測培養(yǎng)基 維生素檢測培養(yǎng)基 一次性衛(wèi)生用品衛(wèi)生檢測培養(yǎng)基 罐頭食品商業(yè)無菌檢測培養(yǎng)基 飲用水及水源檢測培養(yǎng)基 藥品、生物制品檢測培養(yǎng)基 化妝品檢測培養(yǎng)基 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基 啤酒檢驗(yàn)培養(yǎng)基 軍團(tuán)菌檢測培養(yǎng)基 支原體檢測培養(yǎng)基 小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌檢驗(yàn)培養(yǎng)基 彎曲桿菌檢驗(yàn)培養(yǎng)基 產(chǎn)氣莢膜梭菌、肉毒梭菌、厭氧菌檢驗(yàn)培養(yǎng)基 阪崎腸桿菌檢驗(yàn)培養(yǎng)基 溶血性鏈球菌檢測培養(yǎng)基 李斯特氏菌檢測培養(yǎng)基 弧菌檢測培養(yǎng)基 乳酸菌、雙歧桿菌檢測培養(yǎng)基 酵母、霉菌檢測培養(yǎng)基 檢測培養(yǎng)基 沙門氏菌、志賀氏菌檢驗(yàn)培養(yǎng)基 大腸菌群、糞大腸菌群、大腸桿菌及腸桿菌科檢測培養(yǎng)基 細(xì)菌總數(shù)檢測,增菌培養(yǎng)基
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士鋒生物NI-NTA蛋白提純的原理、步驟與常遇問題分析

時(shí)間:2013/9/3閱讀:2543
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 。在蛋白上樣后,帶有標(biāo)簽的蛋白特異性結(jié)合到柱子里,其他的雜蛋白流出。Ni-NTA純化介質(zhì)是Ni離子金屬螯合介質(zhì)。

蛋白過鎳柱純化的原理:Ni柱中的氯化鎳或者硫酸鎳可以與有HIs(組蛋白標(biāo)簽的堿性蛋白蛋白結(jié)合,組蛋白標(biāo)簽一般是6個(gè)堿性氨基酸。在蛋白上樣后,帶有標(biāo)簽的蛋白特異性結(jié)合到柱子里,其他的雜蛋白流出。Ni柱中的氯化鎳或者硫酸鎳可以也可以與咪唑結(jié)合這時(shí)候再用咪唑洗脫,梯度洗脫,咪唑競爭性結(jié)合到硫酸鎳上,目的蛋白就被洗脫了,這時(shí)候收集浸出液,那么里面就是你要的目的蛋白,然后透析掉咪唑就行了。現(xiàn)在的柱子大多是預(yù)裝柱,也就是不用自己填柱,就是裝好鎳的傻瓜柱,也不貴,上樣,洗脫,基本兩個(gè)步驟就結(jié)束了。剩下的看你怎么處理了。

高親和Ni-NTA純化介質(zhì)(L00250)是把螯合劑氮川三乙酸或NTA)共價(jià)偶聯(lián)到瓊脂糖介質(zhì)(4%交聯(lián)上,然后再螯合Ni2+制備而成。NTA能夠通過四個(gè)位點(diǎn)牢固的螯合Ni2+從而減少純化過程中Ni2+泄露到蛋白樣品中。Ni-NTA純化介質(zhì)可以純化任何表達(dá)系統(tǒng)原核,酵母,昆蟲細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞等表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的天然或變性的His-標(biāo)簽蛋白。結(jié)合在介質(zhì)上的蛋白可以通過低pH緩沖液、咪唑溶液甚至溶液洗脫下來。

一、NI-NTA提純操作步驟

1. 試劑和耗材準(zhǔn)備:

Bind Buffer;Wash Buffer;Elution Buffer;柱子;填料;等。

pET.wap.nsA1; PET21空載體; 200ml誘導(dǎo)表達(dá)菌液;

2. 步驟:

2.1 50ml滅菌離心管收集菌液,用冰冷10ml PBS清洗菌液1次,離心

2.2 重懸8ml bind buffer ,冰上超聲破碎,10s間隔,至菌液不在粘稠,分裝至EP管,

2.3 4 14000r/min 20min,分離上清,沉淀用5ml Buffer A+DTT重懸

2.5混勻50%NI-NTA,吸2ml 50%NI-NTA ,上柱2個(gè)柱,1ml NI-NTA/,待*沉淀1h),先用10ml滅菌水洗,流速:重力作用

2.6 10ml 1*Bind Buffer 進(jìn)行平衡,流速:重力作用

2.7 將準(zhǔn)備好的樣品上樣,pET.wap.ns; PET21 only分別上柱結(jié)合時(shí)間1h-1.5h流速控制在0.1ml/min左右, EP 管,分管收集上樣后液體

2.8 10ml 1* Bind Buffer 洗柱子收集洗脫液10管,流速在0.3-0.4ml/min左右

2.9 10ml 1*Wash Buffer洗柱子收集洗脫液10管,流速在0.3-0.4ml/min左右

2.10 5ml 1* Elution Buffer洗柱子收集洗脫液5

2.11 15ml 0.5m NaoH清洗,時(shí)間約0.5-1h(0.5ml/min)

2.12 20%乙醇清洗,約0.5-1h(0.5ml/min)

2.13 封好加樣口,柱子存放4備用

洗脫液-80保藏

試劑配方:

10×NI-NTA Bind Buffer (天然條件Binding/Lysis Buffer,100mL)

50mM NaH2PO4 7.8g NaH2PO4·2H2O(MW 156.01g/mol)

300mM NaCl 17.53g NaCl(MW58.44g/mol)

10mM imidazole 0.68g咪唑(MW68.08g/mol)

NaOH調(diào)整PH8.0,濾膜過濾

10×NI-NTA Wash Buffer (天然條件Wash Buffer,100m L )

50mM NaH2PO4 7.8g NaH2PO4·2H2O (MW 156.01g/mol)

300mM NaCl 17.53g NaCl(MW58.44g/mol)

20mM imidazole 1.36g咪唑(MW68.08g/mol)

NaOH調(diào)整PH8.0,濾膜過濾

10×NI-NTA Elution Buffer(天然條件Elution Buffer.,100m L)

50mM NaH2PO4 7.8g NaH2PO4·2H2O (MW 156.01g/mol)

300mM NaCl 17.53g NaCl(MW58.44g/mol)

250mM imidazole 17.0g咪唑(MW68.08g/mol)

NaOH調(diào)整PH8.0,濾膜過濾

1X PBS (0.1M PBS, pH 7.4):

137mM NaCl(MW58.44g/mol) --------------------------------------------- 8g

2.7mMKCl(MW74.55g/mol)----------------------------------------------- 0.2g

10mMNa2HPO4 (anhydrous) (MW141.98g/mol)----------------------- 1.42 g

2mMKH2PO4 (anhydrous) (MW136.09g/mol) ------------------------- 0.27g

Distilled water ----------------------------------------------------------- 1000 ml

Mix to dissolve and adjust pH to 7.4( HCl ,調(diào)節(jié)

高壓滅菌后,Store this solution at room temperature. Dilute 1:10 with distilled water before use and adjust pH if necessary.

二、Ni-NTA 常見問題及建議

純化的組分中沒有His 標(biāo)簽的蛋白?

首先確定是蛋白沒有掛上柱還是蛋白沒有被洗脫下來。若His 標(biāo)簽蛋白沒有與柱結(jié)合:

可能原因:超聲的功率不對(duì)太大,蛋白炭化,太小,蛋白沒有釋放

策略:改變超聲功率,并在超聲前加入

可能原因:樣品或者是結(jié)合緩沖液不正確:

策略:檢測pH 及樣品和結(jié)合緩沖液的組成份。確保在溶液中鰲合劑或強(qiáng)還原劑的濃度及咪唑的濃度不是太高。

可能原因:標(biāo)簽暴露不*

策略:在變性條件下4-8 M 脲,或4-6 M 鹽酸胍進(jìn)行純化。

可能原因:His 標(biāo)簽丟失

策略1WB 檢查His 是否表達(dá),上游構(gòu)建,改變His-tag 的位置(C- 端或 N- ,必要時(shí)增加His 個(gè)數(shù)。

策略2:孵育的時(shí)間不夠,降低流速和增加孵育的時(shí)間。

策略3:改變螯合的金屬離子,尋找到*的結(jié)合金屬離子。

Ni2+ 通常是從宿主細(xì)胞蛋白中純化大多數(shù)6×His 標(biāo)記的重組蛋白質(zhì)的金屬離子。也是一般zui常用的離子。蛋白和金屬離子之間的結(jié)合強(qiáng)度受幾種因素影響,包括長度、位置、親和標(biāo)記在蛋白的暴露程度、所用離子的類型、以及緩沖液的pH,因此一些蛋白用其他離子可能更容易地進(jìn)行純化而不用Ni2+。

His 標(biāo)簽蛋白若沒有洗脫下來,請(qǐng)依次檢查:

可能原因:洗脫條件太溫和標(biāo)記的蛋白質(zhì)仍然結(jié)合在柱上,結(jié)合力較強(qiáng)

策略:用增加咪唑的梯度洗脫或降低pH 來找出*的洗脫條件。

可能原因:降低pH 的方法洗脫的,因?yàn)槿?/span>pH 低于3.5,會(huì)導(dǎo)致鎳離子脫落

策略:改變洗脫辦法,咪唑競爭性洗脫

可能原因:蛋白已沉淀在柱上

策略:減少上樣量,或使用咪唑的線性梯度而不是分步洗脫以降低蛋白的濃度。試用去污劑或改變NaCl 的濃度,或在變性條件去折疊下洗脫4-8 M 脲,或4-6 M 鹽酸胍。

可能原因:非特異性疏水或其他相互反應(yīng)

策略:加非離子去污劑到洗脫緩沖液如:2% Triton X-100)或增加NaCl 的濃度。

His 標(biāo)簽蛋白洗脫后雜帶較多,什么原因? 如何優(yōu)化?

高純度的蛋白是純化工作者的追求,但是由于很多天然的蛋白也會(huì)帶有HIS,所以經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)HIS 標(biāo)簽蛋白洗脫后有一些雜帶,可能的原因和優(yōu)化的方法如下:

可能原因:蛋白酶部分降解了標(biāo)簽蛋白

策略:請(qǐng)?zhí)砑拥鞍酌敢种苿?/span>

可能原因:雜質(zhì)對(duì)鎳離子有更高的親和性

策略1:咪唑濃度必須優(yōu)化,以確保高純度宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)的低結(jié)合和高產(chǎn)率標(biāo)記的目標(biāo)蛋白質(zhì)的強(qiáng)結(jié)合之間的*平衡。分步或者線性洗脫摸索出*的咪唑結(jié)合和清洗濃度;在樣品中加入與結(jié)合緩沖液同樣濃度的咪唑;咪唑的梯度不大(20 個(gè)或更多的柱床體積,可能分離出有相似結(jié)合強(qiáng)度的蛋白

策略2:篩選的緩沖液條件,NaCl 濃度,pH 的范圍都需要進(jìn)行篩選。對(duì)于單一目標(biāo)蛋白在進(jìn)行緩沖液篩選時(shí),將緩沖液、鹽、甘和還原劑設(shè)計(jì)成不同的混合配方來進(jìn)行優(yōu)化。

策略3:若以上優(yōu)化的條件都不能去除雜質(zhì)蛋白,需要考慮多步純化的思路,如利用Strep 標(biāo)簽進(jìn)行兩步純化或采用Subtractive method 進(jìn)行純化。

可能原因:雜質(zhì)和標(biāo)簽蛋白結(jié)合在一起

策略:在超聲破碎細(xì)胞之前加入去垢劑或者還原劑;增加去垢劑的濃度( 2% Triton X-100 or 2% Tween 20);或者在Wash buffer 中增加甘的濃度(50%) 減少非特異性的相互反應(yīng);考慮增加咪唑的濃度或者改變金屬離子。

可能原因:洗滌不充分

策略:增加洗滌的次數(shù),使洗滌充分。

蛋白過鎳柱純化步驟中,因?yàn)楝F(xiàn)在很多都是預(yù)裝柱,也就不用自己裝填料了,一般的蛋白純化也就只有上樣和洗脫兩個(gè)步驟了。需要注意的是純化過程中流速不應(yīng)該過快。

 

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