活體生物發(fā)光成像技術(shù)的原理：在小型哺乳動物體內(nèi)利用報告基因（熒光素酶基因）表達所產(chǎn)生的熒光素酶蛋白與其小分子底物熒光素在氧、Mg²⁺ 存在的條件下消耗ATP發(fā)生氧化還原反應(yīng)，將部分化學(xué)能轉(zhuǎn)化為可見光能釋放。因此只有在活細胞內(nèi)才會發(fā)生發(fā)光現(xiàn)象。并且光的強度與標(biāo)記細胞的數(shù)目線性相關(guān)。

裸鼠

DMEM培養(yǎng)基胎牛血清*熒光素底物*注射液

Kodak多模式活體成像系統(tǒng)ZetePALS型激光動態(tài)光散射粒度儀

一、材料準(zhǔn)備

1.  動物：裸鼠9 只，6～8周齡，雄性；C57小鼠24 只，6～8 周齡，雄性；動物均為自由飲水采食。

2.  細胞：MDA-MB-231人乳腺癌細胞系，使用熒光素酶基因標(biāo)記。方法：用熒光素酶報告基因標(biāo)記的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人乳腺癌細胞， 共轉(zhuǎn)染的還有選擇性標(biāo)記基因，從而保證轉(zhuǎn)染 細胞的穩(wěn)定性，形成表達熒光素酶的腫瘤細胞株；B16 黑色素瘤細胞。

二、實驗步驟

1.  *混合膠束的制備

（1）將適量*溶解在少量無水乙醇和丙二醇的混合溶劑中.

（2） 加入適當(dāng)比例的磷脂和表面活性劑A 進行充分混合，制得穩(wěn)定的*混合膠束前體制劑，載藥濃度為6 g/L。

（3）臨用時按劑量加入生理鹽水中稀釋、搖勻后即可使用。制劑體系的粒徑大小與分布特征采用動態(tài)激光光散射粒度儀檢測。

2.  MDA-MB-231人乳腺癌細胞荷瘤鼠模型的建立

（1）培養(yǎng)熒光素酶基因標(biāo)記的MDA-MB-231人乳腺癌細胞系，使用DMEM 培養(yǎng)基（添加 10%胎牛血清），37 ℃、5% CO₂ 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3天傳代1次。

（2）待細胞密度為80%～90%、細胞總量達到實驗所需要求時，使用*消化，收集于PBS溶液重懸。

（3）如有需要，在細胞培養(yǎng)一定時間后，應(yīng)使用抗生素 Zeocin進行抗性篩選，  保證熒光素酶基因的表達量足夠。

（4）收集細胞，使用PBS稀釋至細胞數(shù)1.5×10⁸/mL，接種于裸鼠腋下，每只裸鼠的接種量為0.1 mL 。

3.  動物活體成像檢測

（1）接種后將裸鼠隨機分為3組，分別為生理鹽水組、*注射液組、*混合膠束制劑組，每組3只。

（2）腫瘤接種后第8天開始給藥，劑量為 15 mg/kg，每3天腹腔注射給藥1次。從第1次給藥開始，每7天進行1次活體成像檢測。

（3）采用戊*對裸鼠進行麻醉（劑量為 60~80 mg/kg），  10~15 min 后裸鼠即處于昏迷狀態(tài)。

（4）腹腔注射熒光素底物（150 mg/kg）， 發(fā)射光波長在540~600 nm。注射后15~35 min 觀測，  為熒光強度zui高的時段。

4.  活體成像儀參數(shù)設(shè)置

（1）將2~3只小鼠并排放入暗室中，熒光素酶與底物反應(yīng)后產(chǎn)生的發(fā)光不需要激發(fā)，可以自發(fā)光，只需調(diào)整CCD相機的曝光時間拍照即可。

（2） 選用3 min 曝光時間，使用軟件Kodak MI In Vivo Fx Pro處理圖像，增加偽彩。

（3）觀察腫瘤區(qū)域的影像，并根據(jù)活體成像圖片測量圖中腫瘤大小，進行統(tǒng)計分析。

5.  在整個實驗過程中，給藥的同時監(jiān)測裸鼠體重，采用游標(biāo)卡尺測量腫瘤大小，運用公式V = π•（6ab²）^-1計算腫瘤體積， 繪制腫瘤生長曲線，并與活體成像結(jié)果進行比較，考察*制劑的抑瘤效果以及利用活體成像方法評價藥物抑瘤作用的可行性和準(zhǔn)確 性。

6.  生存周期的測定

（1）在活體成像實驗的基礎(chǔ)上，研究不同*制劑對B16黑色素瘤C57小鼠的生存期的影響。

（2）首先培養(yǎng)B16黑色素瘤細胞，以PBS調(diào)整細胞數(shù)至5×10⁶/mL。采用右后肢皮下注射，每只C57小鼠注射0.1 mL，即細胞數(shù)為5×10⁵。

（3）接種后常溫下正常飲食飼養(yǎng)，于腫瘤接種后第6天，腫瘤直徑達0.2 cm 左右時，隨機將C57小鼠分成3組，分別為生理鹽水組、Taxol 組、PMM 組，每組8只。

（4）采取腹腔注射給藥法，每隔3天給藥1次，給藥劑量為15 mg/kg。

（5）每天觀察小鼠，以天為單位記錄死亡時間并繪制生存周期曲線，并計算平均生存周期。
 

7.  統(tǒng)計學(xué)方法所有統(tǒng)計的實驗數(shù)據(jù)以x ± s表示，采用SPSS軟件對比較的樣本進行 t 檢驗。

基于生物發(fā)光原理的活體動物腫瘤成像技術(shù)方法，能準(zhǔn)確標(biāo)記和得到邊界清晰的實時在體腫瘤影像，可以有效解決染料熒光標(biāo)記技術(shù)特異性差、干擾信號強、局域信號不明顯等缺點。

作為一種新興發(fā)展的實時、在體和*傷監(jiān)測技術(shù)，其安全性、實時性、準(zhǔn)確性等方面具有較大的優(yōu)勢，能夠為藥效動物實驗研究與評價提供更科學(xué)準(zhǔn)確的依據(jù)。

當(dāng)然，活體 動物成像技術(shù)的應(yīng)用還存在許多不足和困難，如本文由于使用儀器配置所限，采用的是二維活體成像系統(tǒng)，若采用三維活體成像系統(tǒng)獲得活體腫瘤三維立體圖像，則能夠獲得更多關(guān)于腫瘤形態(tài)大小等的信息。

另外，目前具有生物發(fā)光特征的細胞品系種類較少，一般是根據(jù)需要自制細胞，制備技術(shù)過程復(fù)雜，成本較高，因此需要建立不同腫瘤模型時存在困難，限制了該方法的應(yīng)用范圍。

*是目前臨床上廣泛使用的一種抗腫瘤藥物，其溶解度較低市售*注射液是采用聚氧乙烯*和無水乙醇為溶劑制成，其主要問題是Cremophor EL帶來的嚴重過敏反應(yīng)和神經(jīng)毒性等。

本文采用磷脂和一種新型的表面活性劑制成混合膠束系統(tǒng)，可有效解決*的溶解性問題，并且避免Cremophor EL的毒性問題。

從給藥后的活體動物成像結(jié)果可見：Taxol和PMM制劑均可有效抑制腫瘤生長，但兩者并無顯著性差異；但從給藥后裸鼠體重變化以及狀態(tài)可見，混合膠束組裸鼠進食和活動正常，體重比較穩(wěn)定，而Taxol組裸鼠狀態(tài)萎靡不振，進食較少，體重有所下降。

這些結(jié)果表明，與Taxol相比，PMM制劑在一定程度上提高了裸鼠對藥物的順應(yīng)性，不良反應(yīng)有所降低；進一步的生存周期實驗結(jié)果也表明，Taxol和PMM制劑提高了C57荷瘤小鼠的存活時間，同時給予PMM的C57荷瘤鼠平均生存周期更長。

分析PMM制劑的抑瘤效果以及提高生存周期的原因，可能是PMM中磷脂的存在會使膠束自發(fā)地形成藥物脂質(zhì)納米粒，而改變藥物的體內(nèi)分布特性，使其更好地發(fā)揮藥效；同時所采用的新型表面活性劑能夠降低組胺釋放，從而降低制劑的毒性，提高藥物的安全性。