活體生物發(fā)光成像技術(shù)的原理：在小型哺乳動(dòng)物體內(nèi)利用報(bào)告基因（熒光素酶基因）表達(dá)所產(chǎn)生的熒光素酶蛋白與其小分子底物熒光素在氧、Mg²⁺ 存在的條件下消耗ATP發(fā)生氧化還原反應(yīng)，將部分化學(xué)能轉(zhuǎn)化為可見光能釋放。因此只有在活細(xì)胞內(nèi)才會(huì)發(fā)生發(fā)光現(xiàn)象。并且光的強(qiáng)度與標(biāo)記細(xì)胞的數(shù)目線性相關(guān)。

裸鼠

DMEM培養(yǎng)基胎牛血清*熒光素底物*注射液

Kodak多模式活體成像系統(tǒng)ZetePALS型激光動(dòng)態(tài)光散射粒度儀

一、材料準(zhǔn)備

1.  動(dòng)物：裸鼠9 只，6～8周齡，雄性；C57小鼠24 只，6～8 周齡，雄性；動(dòng)物均為自由飲水采食。

2.  細(xì)胞：MDA-MB-231人乳腺癌細(xì)胞系，使用熒光素酶基因標(biāo)記。方法：用熒光素酶報(bào)告基因標(biāo)記的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人乳腺癌細(xì)胞， 共轉(zhuǎn)染的還有選擇性標(biāo)記基因，從而保證轉(zhuǎn)染 細(xì)胞的穩(wěn)定性，形成表達(dá)熒光素酶的腫瘤細(xì)胞株；B16 黑色素瘤細(xì)胞。

二、實(shí)驗(yàn)步驟

1.  *混合膠束的制備

（1）將適量*溶解在少量無水乙醇和丙二醇的混合溶劑中.

（2） 加入適當(dāng)比例的磷脂和表面活性劑A 進(jìn)行充分混合，制得穩(wěn)定的*混合膠束前體制劑，載藥濃度為6 g/L。

（3）臨用時(shí)按劑量加入生理鹽水中稀釋、搖勻后即可使用。制劑體系的粒徑大小與分布特征采用動(dòng)態(tài)激光光散射粒度儀檢測(cè)。

2.  MDA-MB-231人乳腺癌細(xì)胞荷瘤鼠模型的建立

（1）培養(yǎng)熒光素酶基因標(biāo)記的MDA-MB-231人乳腺癌細(xì)胞系，使用DMEM 培養(yǎng)基（添加 10%胎牛血清），37 ℃、5% CO₂ 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3天傳代1次。

（2）待細(xì)胞密度為80%～90%、細(xì)胞總量達(dá)到實(shí)驗(yàn)所需要求時(shí)，使用*消化，收集于PBS溶液重懸。

（3）如有需要，在細(xì)胞培養(yǎng)一定時(shí)間后，應(yīng)使用抗生素 Zeocin進(jìn)行抗性篩選，  保證熒光素酶基因的表達(dá)量足夠。

（4）收集細(xì)胞，使用PBS稀釋至細(xì)胞數(shù)1.5×10⁸/mL，接種于裸鼠腋下，每只裸鼠的接種量為0.1 mL 。

3.  動(dòng)物活體成像檢測(cè)

（1）接種后將裸鼠隨機(jī)分為3組，分別為生理鹽水組、*注射液組、*混合膠束制劑組，每組3只。

（2）腫瘤接種后第8天開始給藥，劑量為 15 mg/kg，每3天腹腔注射給藥1次。從第1次給藥開始，每7天進(jìn)行1次活體成像檢測(cè)。

（3）采用戊*對(duì)裸鼠進(jìn)行麻醉（劑量為 60~80 mg/kg），  10~15 min 后裸鼠即處于昏迷狀態(tài)。

（4）腹腔注射熒光素底物（150 mg/kg）， 發(fā)射光波長(zhǎng)在540~600 nm。注射后15~35 min 觀測(cè)，  為熒光強(qiáng)度zui高的時(shí)段。

4.  活體成像儀參數(shù)設(shè)置

（1）將2~3只小鼠并排放入暗室中，熒光素酶與底物反應(yīng)后產(chǎn)生的發(fā)光不需要激發(fā)，可以自發(fā)光，只需調(diào)整CCD相機(jī)的曝光時(shí)間拍照即可。

（2） 選用3 min 曝光時(shí)間，使用軟件Kodak MI In Vivo Fx Pro處理圖像，增加偽彩。

（3）觀察腫瘤區(qū)域的影像，并根據(jù)活體成像圖片測(cè)量圖中腫瘤大小，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

5.  在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，給藥的同時(shí)監(jiān)測(cè)裸鼠體重，采用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤大小，運(yùn)用公式V = π•（6ab²）^-1計(jì)算腫瘤體積， 繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線，并與活體成像結(jié)果進(jìn)行比較，考察*制劑的抑瘤效果以及利用活體成像方法評(píng)價(jià)藥物抑瘤作用的可行性和準(zhǔn)確 性。

6.  生存周期的測(cè)定

（1）在活體成像實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，研究不同*制劑對(duì)B16黑色素瘤C57小鼠的生存期的影響。

（2）首先培養(yǎng)B16黑色素瘤細(xì)胞，以PBS調(diào)整細(xì)胞數(shù)至5×10⁶/mL。采用右后肢皮下注射，每只C57小鼠注射0.1 mL，即細(xì)胞數(shù)為5×10⁵。

（3）接種后常溫下正常飲食飼養(yǎng)，于腫瘤接種后第6天，腫瘤直徑達(dá)0.2 cm 左右時(shí)，隨機(jī)將C57小鼠分成3組，分別為生理鹽水組、Taxol 組、PMM 組，每組8只。

（4）采取腹腔注射給藥法，每隔3天給藥1次，給藥劑量為15 mg/kg。

（5）每天觀察小鼠，以天為單位記錄死亡時(shí)間并繪制生存周期曲線，并計(jì)算平均生存周期。
 

7.  統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有統(tǒng)計(jì)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x ± s表示，采用SPSS軟件對(duì)比較的樣本進(jìn)行 t 檢驗(yàn)。

基于生物發(fā)光原理的活體動(dòng)物腫瘤成像技術(shù)方法，能準(zhǔn)確標(biāo)記和得到邊界清晰的實(shí)時(shí)在體腫瘤影像，可以有效解決染料熒光標(biāo)記技術(shù)特異性差、干擾信號(hào)強(qiáng)、局域信號(hào)不明顯等缺點(diǎn)。

作為一種新興發(fā)展的實(shí)時(shí)、在體和*傷監(jiān)測(cè)技術(shù)，其安全性、實(shí)時(shí)性、準(zhǔn)確性等方面具有較大的優(yōu)勢(shì)，能夠?yàn)樗幮?dòng)物實(shí)驗(yàn)研究與評(píng)價(jià)提供更科學(xué)準(zhǔn)確的依據(jù)。

當(dāng)然，活體 動(dòng)物成像技術(shù)的應(yīng)用還存在許多不足和困難，如本文由于使用儀器配置所限，采用的是二維活體成像系統(tǒng)，若采用三維活體成像系統(tǒng)獲得活體腫瘤三維立體圖像，則能夠獲得更多關(guān)于腫瘤形態(tài)大小等的信息。

另外，目前具有生物發(fā)光特征的細(xì)胞品系種類較少，一般是根據(jù)需要自制細(xì)胞，制備技術(shù)過程復(fù)雜，成本較高，因此需要建立不同腫瘤模型時(shí)存在困難，限制了該方法的應(yīng)用范圍。

*是目前臨床上廣泛使用的一種抗腫瘤藥物，其溶解度較低市售*注射液是采用聚氧乙烯*和無水乙醇為溶劑制成，其主要問題是Cremophor EL帶來的嚴(yán)重過敏反應(yīng)和神經(jīng)毒性等。

本文采用磷脂和一種新型的表面活性劑制成混合膠束系統(tǒng)，可有效解決*的溶解性問題，并且避免Cremophor EL的毒性問題。

從給藥后的活體動(dòng)物成像結(jié)果可見：Taxol和PMM制劑均可有效抑制腫瘤生長(zhǎng)，但兩者并無顯著性差異；但從給藥后裸鼠體重變化以及狀態(tài)可見，混合膠束組裸鼠進(jìn)食和活動(dòng)正常，體重比較穩(wěn)定，而Taxol組裸鼠狀態(tài)萎靡不振，進(jìn)食較少，體重有所下降。

這些結(jié)果表明，與Taxol相比，PMM制劑在一定程度上提高了裸鼠對(duì)藥物的順應(yīng)性，不良反應(yīng)有所降低；進(jìn)一步的生存周期實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，Taxol和PMM制劑提高了C57荷瘤小鼠的存活時(shí)間，同時(shí)給予PMM的C57荷瘤鼠平均生存周期更長(zhǎng)。

分析PMM制劑的抑瘤效果以及提高生存周期的原因，可能是PMM中磷脂的存在會(huì)使膠束自發(fā)地形成藥物脂質(zhì)納米粒，而改變藥物的體內(nèi)分布特性，使其更好地發(fā)揮藥效；同時(shí)所采用的新型表面活性劑能夠降低組胺釋放，從而降低制劑的毒性，提高藥物的安全性。