細(xì)胞樣品

甲醛*PBSSDS Lysis Buffer洗脫液RNaseA蛋白酶Komega膠回收試劑盒

離心管超聲儀電泳儀離心機

一、細(xì)胞的甲醛交聯(lián)與超聲破碎（ *天）

1.  取出1平皿細(xì)胞（10 cm平皿），加入243 ul 37%甲醛，使得甲醛的終濃度為1%（培養(yǎng)基共有9 ml）。

2.  37℃孵育10 min。

3.  終止交聯(lián)：加*至終濃度為0.125 M。450 ul 2.5 M*于平皿中。混勻后，在室溫下放置5 min即可。

4.  吸盡培養(yǎng)基，用冰冷的PBS清洗細(xì)胞2次。

5.  細(xì)胞刮刀收集細(xì)胞于15 ml離心管中（PBS依次為5 ml，3 ml和3 ml）。預(yù)冷后2 000 rpm 5 min收集細(xì)胞。

6.  倒去上清。按照細(xì)胞量，加入SDS Lysis Buffer。使得細(xì)胞終濃度為每200ul含2×10⁶個細(xì)胞。這樣每100 ul溶液含1×10⁶個細(xì)胞。再加入蛋白酶抑制劑復(fù)合物。假設(shè)MCF7長滿板為5×10⁶個細(xì)胞。本次細(xì)胞長得約為80%。即為4×10⁶個細(xì)胞。因此每管加入400 ul SDS Lysis Buffer。將2管混在一起，共800 ul。

7.  超聲破碎：VCX750，25%功率，4.5 s沖擊，9 s間隙。共14次。

二、除雜及抗體哺育 （ *天）

1.  超聲破碎結(jié)束后，10 000 g 4℃離心10 min。去除不溶物質(zhì)。

2.  留取300ul做實驗，其余保存于-80℃。

3.  300 ul中，100 ul加抗體做為實驗組；100 ul不加抗體做為對照組；100 ul加入4 ul 5 M NaCl（NaCl終濃度為0.2 M），65℃處理3 h解交聯(lián)，跑電泳，檢測超聲破碎的效果。

4.  在100 ul的超聲破碎產(chǎn)物中，加入900 ul ChIP DilutionBuffer和20 ul的50×PIC。

再各加入60 ul ProteinA Agarose/SalmonSpermDNA。4℃顛轉(zhuǎn)混勻1 h。

5.  1 h后，在4℃靜置10 min沉淀，700 rpm離心1 min。

6.  取上清。各留取20 ul做為input。一管中加入1 ul抗體，另一管中則不加抗體。4℃顛轉(zhuǎn)過夜。

三、檢驗超聲破碎的效果 （ *天）

1.  取100 ul超聲破碎后產(chǎn)物，加入4 ul 5M NaCl，65℃處理2 h解交聯(lián)。

2.  分出一半用酚/氯仿抽提。電泳檢測超聲效果。

四、免疫復(fù)合物的沉淀及清洗（ 第二天）

1.  孵育過夜后，每管中加入60 ul ProteinA  Agarose/SalmonSperm DNA。4℃顛轉(zhuǎn)2 h。

2.  4℃靜置10 min后，700 rpm離心1 min。除去上清。

3.  依次用下列溶液清洗沉淀復(fù)合物。清洗的步驟：加入溶液，在4℃顛轉(zhuǎn)10 min，4℃靜置10 min沉淀，700 rpm離心1 min，除去上清。

洗滌溶液：

（1）low salt wash buffer-one wash

（2）highsalt wash buffer-one wash

（3）LiCl wash buffer-one wash

（4）TE buffer-two wash

4.  清洗完畢后，開始洗脫。

洗脫液的配方：100 ul 10%SDS，100 ul1M NaHCO₃，800 ul ddH₂O，共1 ml。

每管加入250 ul洗脫buffer，室溫下顛轉(zhuǎn)15 min，靜置離心后，收集上清。重復(fù)洗滌一次。zui終的洗脫液為每管500 ul。

5.  解交聯(lián)：每管中加入20 ul 5M NaCl（NaCl終濃度為0.2 M）。

6.  混勻，65℃解交聯(lián)過夜。

五、DNA樣品的回收（第三天）

1.  解交聯(lián)結(jié)束后，每管加入1 ul RNaseA（MBI），37℃孵育1 h。

2.  每管加入10 ul 0.5 M EDTA，20 ul1M Tris.HCl（PH6.5），2 ul 10 mg/ml蛋白酶K。45℃處理2 h。

3.  DNA片段的回收----omega膠回收試劑盒。zui終的樣品溶于100 ul ddH₂O。

六、PCR分析（第三天）