儀器用具：
37℃培養(yǎng)箱及冰浴
Electroporation cuvette （electrode gap, 0.1 cm）
Electroporator （Bio-Rad, IBI geneZapper 或其它廠牌）
藥品試劑：
無菌水 （置冰浴中）
10% glycerol （置冰浴中）
SOB 液體培養(yǎng)基
SOB 固體培養(yǎng)基
SOC 液體培養(yǎng)基
SOC/Amp 固體培養(yǎng)基
大腸桿菌JM109
Ligation mixtures
方法步驟：
菌體的處理：
1） 進行轉(zhuǎn)形實驗的前16~20 h,將菌種JM109 接種在SOB 固體 培養(yǎng)基上,并在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng).
34 Methods in Biotechnology Vol 1
2） 取80 mL SOB培養(yǎng)基裝入250 mL滅過菌的三角瓶. 另取1 mL SOB加于微量離心管中.由SOB固體培養(yǎng)基上選8 個約2~3 mm大小的單一菌落接入1mL SOB中,震蕩將菌體打散后,加入80 mL SOB中,于37℃震蕩培養(yǎng)約2~3h,直至細胞數(shù)約為4~7×107/mL.
3） 收集菌液于離心管中,置冰浴中10 min.
4） 以750~1,000 g 離心12~15 min （4℃）.
5） 倒去上清,并盡量將液體倒干,或以微量移液器頭吸干凈.
6） 沉淀加入80 mL 冰冷的無菌水,稍加震蕩,混合均勻后以750~1,000 g 離心12~15 min （4℃）.
7） 倒去上清,菌體再依序以40 mL 及1.6 mL 無菌水同法處理.
8） 菌體以0.16 mL 冰冷的10% glycerol 懸濁.
9） 菌液每80 μL分裝一管,可直接用于electroporation,或以液態(tài)氮或干冰快速凍結(jié)后置 -70℃貯存.
Electroporation:
1） 進行electroporation 的DNA樣品溶液中離子強度不可過高,DNA 需先經(jīng)過透析或以酒精沉淀處理.透析可如2.3.1 節(jié)步驟15） 進行.
2） Cuvettes 自包裝中取出后,置冰浴中至少5 min.
3） 將菌液置于冰浴中,加入DNA 樣品,混合后,小心將溶液吸至cuvette 的凹槽中,將cuvette 置冰浴中.
4） 進行electroporation 時,將cuvette 由冰浴中取出,將四周水份擦干,置于反應(yīng)槽中,并接上電極線.
5） 以2.5 kV, 21 μF 進行electroporation.
◆ 注意！高電壓！
6） 取出cuvette,立即加入1 mL SOC.
7） 吸出菌液移至微量離心管中,于37℃震蕩培養(yǎng)45 min.
8） 取200 μL 菌液涂布于SOC/Amp plate.置37℃培養(yǎng)16~20 h.
9） 觀察plate 上菌落的形狀并計算菌落數(shù).