1適用范圍：適用于定量分析LGG純菌種及LGG乳制品中的LGG菌數(shù)量。

2定義：LGG是一種鼠李糖乳桿菌菌株(ATCC 53103)，革蘭氏陽性，過氧化物酶陰性，棒狀，鏈形，不發(fā)酵乳糖，對*有抗性。

3原理：樣品經(jīng)稀釋劑稀釋后均質(zhì)，然后按10倍的稀釋倍數(shù)接種到選擇性瓊脂培養(yǎng)基中，厭氧培養(yǎng)，計(jì)數(shù)所有的菌落，結(jié)果以cuf/g計(jì)。

注：培養(yǎng)過程中，所有*抗性的菌株都會生長（比如所有的鼠李糖乳桿菌，干酪乳桿菌，胚芽乳桿菌等）。但是，由于LGG不發(fā)酵乳糖，所以可以很容易地區(qū)分開來。進(jìn)一步分析鑒定則可采用基因的方法。

4儀器和玻璃器皿

只要規(guī)格可以滿足要求，采用一次性或可重復(fù)使用的儀器均可。除了微生物實(shí)驗(yàn)室所常用的儀器外，下列儀器是必需的：

烘箱；    高壓殺菌鍋；   培養(yǎng)箱（37℃±1℃）；      水?。?4-47℃）；

混合器（Peristaltic-type）；帶有無菌塑料袋；        天平。

5培養(yǎng)基和試劑

5.1 稀釋液準(zhǔn)備

蛋白棟1.0g；        氯化鈉8.5g；      去離子水1000mL。

若需要，可緩慢加熱至*溶解。將溶液分至一些瓶子中，然后在高壓殺菌鍋中進(jìn)行殺菌（121℃±1℃，15分鐘）。殺菌后，溶液pH7.0±0.2。

每個瓶子均可在常溫下貯存半年。

5.2 培養(yǎng)基

5.2.1 MRS瓊脂培養(yǎng)基：適用于純LGG菌種檢測。高壓殺菌后pH6.4±0.2,4-6℃條件下可貯存6個月。

5.2.2 MRS-*瓊脂培養(yǎng)基（MRS-V）：適用于LGG菌種與普通酸奶菌種混合后的檢測。*50mg/L, 可以在高壓殺菌前加入，也可以作為無菌濾液加入瓊脂中。

5.2.3 MRSL肉湯培養(yǎng)基（檢測乳糖發(fā)酵特性）

分別溶解于5-10mL乙醇中，然后加入肉湯中。取5mL試樣，高壓殺菌（121℃±1℃，15分鐘）后作測試用。殺菌后，溶液pH7.2±0.2。

6步驟

6.1 樣品制備

樣品制備前，先放置于室溫下1-2小時，以使其溫度與室溫相同。稱取10g樣品于無菌塑料袋中，加入90ml無菌蛋白胨-氯化鈉水溶液。將塑料袋放入混合器中混合60秒，以確保懸浮液均勻一致。這是*個稀釋10倍的樣液，該溶液必須繼續(xù)按10倍的倍數(shù)進(jìn)行稀釋，且必須在15分鐘內(nèi)將各樣液接種到培養(yǎng)皿中。

6.2 在選擇性瓊脂培養(yǎng)基中接種

選擇合適的瓊脂培養(yǎng)基：純菌種用MRS瓊脂培養(yǎng)基，混合菌種用MRS-*瓊脂培養(yǎng)基。取1mL（傾倒法，即Pour-plate method）或0.1mL（涂抹法，即spread-plate method）每一稀釋度的樣液分別接種到兩個培養(yǎng)皿中，瓊脂的溫度應(yīng)為44-47℃，然后于厭氧條件下進(jìn)行培養(yǎng)（37±1℃，72±6小時）。

6.3 菌落計(jì)數(shù)

計(jì)數(shù)那些LGG菌落在10-300之間的培養(yǎng)皿。LGG菌落特征：光滑、大、白色、圓形或橢圓形、邊緣清晰。

6.4 確認(rèn)實(shí)驗(yàn)

為了進(jìn)一步確認(rèn)菌落是否為LGG，可從菌落中挑取一些純菌種，進(jìn)行顯微鏡觀察和乳糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)（MRSL肉湯）。做乳糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)時，將挑取的純菌種接種到肉湯培養(yǎng)基后，有氧培養(yǎng)（37±1℃，1-2天）。由于LGG不發(fā)酵乳糖，故肉湯應(yīng)是紫色的（未變色）。而若是能夠利用乳糖的微生物，則肉湯變?yōu)辄S色。實(shí)驗(yàn)時，利用純LGG菌種和任一能夠利用乳糖的其它菌種進(jìn)行對照實(shí)驗(yàn)。

7結(jié)果          以每克樣品中LGG的菌落數(shù)表示，即cfu/g。

8注意事項(xiàng)：

1）、制備培養(yǎng)基，滅菌前可將*加到MRS-A培養(yǎng)基中混均，按照培養(yǎng)基標(biāo)簽上使用說明進(jìn)行滅菌；

2）、檢樣前需將樣品在室溫下放置1-2小時，使其溫度與室溫相同，稱取樣品時應(yīng)將包含LGG益生菌的部分接入稀釋液中，混勻進(jìn)行接種；

3）、根據(jù)樣品特性，接種稀釋倍數(shù)可選擇10-4和10-5，每個稀釋度分別接種兩個平皿；

4）、樣品制備完畢，將各樣液接種到培養(yǎng)皿，傾倒溫度為44-47℃培養(yǎng)基，整個操作過程必須在15分鐘內(nèi)完成，同時做瓊脂空白試驗(yàn)；

5）、待瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平皿放入?yún)捬豕蓿俜湃雲(yún)捬鯗y試條，然后放入產(chǎn)氣袋，產(chǎn)氣袋放入后應(yīng)立即將蓋蓋嚴(yán)，避免產(chǎn)氣袋在空氣中暴露時間過長；

6）、檢樣放入?yún)捬豕藓笤谝?guī)定的培養(yǎng)條件下進(jìn)行培養(yǎng)，并隨時觀察厭氧測試條顏色變化情況（無氧為白色，有氧時為粉色），保證培養(yǎng)條件*達(dá)到無氧狀態(tài)；放入測試條時注意不要靠壁，使其處于自然狀態(tài)。（一般在放入培養(yǎng)箱后3-5小時后觀察，如測試條顏色發(fā)生變化，應(yīng)再放入產(chǎn)氣袋重新進(jìn)行測試）。