一、目的和要求

1. 了解管碟法的原理。

2. 掌握二劑量法測定抗生素效價單位的技術(shù)和計算方法。

二、原理

抗生素的生物檢定是以抗生素對微生物的抗菌效力作為效價的衡量標(biāo)準(zhǔn)，具有與應(yīng)用原理相一致、用量少和靈敏度高等優(yōu)點。管碟法是瓊脂擴(kuò)散法中的一種，已被各國藥典廣泛采用，作為法定的抗生素生物檢定方法。

當(dāng)抗生素在菌層培養(yǎng)基中擴(kuò)散時，會形成抗生素濃度由高到低的自然梯度，即擴(kuò)散中心濃度高而邊緣濃度低。因此，當(dāng)抗生素濃度達(dá)到或高于MIC（zui低抑制濃度）時，試驗菌就被抑制而不能繁殖，從而呈現(xiàn)透明的抑菌圈。根據(jù)擴(kuò)散定律的推導(dǎo)，抗生素總量的對數(shù)值與抑菌圈直徑的平方成線性關(guān)系。

三、實驗材料

1. 四環(huán)素類抗生素的標(biāo)準(zhǔn)品和樣品。

2. 試驗菌：藤黃八疊球菌（Sarcina lutea）。

3. 培養(yǎng)基：250ml三角瓶分裝150ml LB瓊脂，150ml三角瓶分裝50ml LB瓊脂，50ml三角瓶分裝20ml藤黃八疊球菌懸液用培養(yǎng)液。

4. 滅菌物品：培養(yǎng)皿，牛津杯（內(nèi)徑：6.0±0.1mm，外徑：7.8±0.1mm，高度：10.0±0.1mm），滴管，1ml吸管，pH6.0的磷酸緩沖液，彎頭鑷子，15×150mm試管，瓦蓋。

5. 其它：分析天平，容量瓶，玻璃板，水平儀，游標(biāo)卡尺。

四、實驗實施

1. 配制標(biāo)準(zhǔn)品溶液

2. 配制樣品溶液

3. 制備菌懸液。

4. 制備平板：

（1）取6套無菌培養(yǎng)皿，分別加入約20mlLB培養(yǎng)基后，置水平玻璃板上凝固，作為底層。

（2）另取冷卻至50℃左右的50ml LB培養(yǎng)基，加入1ml試驗菌懸液，迅速搖勻后，用10ml破口吸管取6ml混菌培養(yǎng)基倒在底層平板上，作為菌層，并放置在水平玻璃板上凝固。

5. 在培養(yǎng)基平板底部作好相應(yīng)標(biāo)記，用彎頭鑷子在每個培養(yǎng)皿中等距離放入4個牛津杯。

6. 用滴管分別將高、低濃度的標(biāo)準(zhǔn)品和樣品溶液加入到牛津杯中，以滴滿為度，換上皿蓋。

7. 將培養(yǎng)皿平穩(wěn)送入恒溫箱，37℃下培養(yǎng)16～18h。

8. 用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑