一、試劑及材料（試劑盒包含內(nèi)容）
1. 膜芯片---（RayBio®Human Cytokine Antibody Array membranes ，2/4/8張膜）
2. *標(biāo)記抗體---（Biotin-Conjugated Anti-Cytokines， 1/2/4 管， 每2張膜配1個(gè)管）
3. 1000×HRP-鏈霉親和素---（HRP-Conjugated Streptavidin，1管）
4. 1X封閉緩沖液---（Blocking Buffer，2/4張膜配25 ml，8張膜配50 ml）
5. 20X的洗液I ---（20X Wash Buffer I，2/4張膜配10 ml，8張膜配20 ml）
6. 20X 的洗液II---（20X Wash Buffer II，2/4張膜配10 ml，8張膜配20 ml）
7. 2X細(xì)胞裂解液---（2X Cell Lysis Buffer，2/4張膜配10 ml，8張膜配20 ml）
8. 檢測(cè)緩沖液C---（Detection Buffer C， 2/4張膜配1.5 ml，8張膜配2.5 ml）
9. 檢測(cè)緩沖液D---（Detection Buffer D， 2/4張膜配1.5 ml，8張膜配2.5 ml）
10. 8孔孵育板---（Eight-Well Tray， 每個(gè)試劑盒配1個(gè)）
11. 操作手冊(cè)
二、所需的材料及儀器
1. 搖床
2. 塑料保鮮膜
3. 雙蒸餾水
4. 膠片及膠片顯影機(jī)或者化學(xué)發(fā)光成像儀
三、操作程序
1. 樣品的準(zhǔn)備
（1）盡量使用無血清條件培養(yǎng)基。
（2）如果必須使用含有血清的條件培養(yǎng)基，我們強(qiáng)烈建議使用*培養(yǎng)基作為對(duì)照，因?yàn)檠逯泻幸欢康募?xì)胞因子。
（3）對(duì)于細(xì)胞和組織裂解液，我們推薦使用RayBio®細(xì)胞裂解液從細(xì)胞或者組織中提取蛋白（采用均質(zhì)機(jī)）。用去離子水稀釋2×細(xì)胞裂解液（我們推薦使用裂解液前添加蛋白酶抑制劑），提取蛋白后，離心樣品取上清，檢測(cè)蛋白濃度。
（4）我們推薦使用：1 ml的條件培養(yǎng)基（未稀釋的），或者1 ml的2-5倍稀釋的血清或者血漿，或者200-250 µg總蛋白的細(xì)胞和組織裂解液，裂解液至少用1×封閉液稀釋10倍。
注：樣品的量取決于細(xì)胞因子的量，如果信號(hào)太弱，就使用更多量的樣品，如果信號(hào)太強(qiáng)，樣品可進(jìn)一步稀釋，如果背景太高，也要進(jìn)一步稀釋樣品。
2. 膜芯片的操作
（1）用鑷子來進(jìn)行膜的操作，用鑷子夾住膜的邊緣或者用鑷子托起膜，避免夾在膜上有抗體的地方，膜比較脆，容易夾破，操作過程要保持輕柔。
（2）試驗(yàn)整個(gè)過程中膜芯片不能干燥。
（3）避免用手、吸頭、或者任何尖銳的工具接觸到膜。
3. 膜芯片的孵育注意事項(xiàng)
（1）樣品或者試劑要將膜全部覆蓋，孵育過程中要將孵育盒的蓋子蓋上，可以使用塑料薄膜包住孵育盒，避免灰塵和樣品的蒸發(fā)。
（2）加樣和孵育過程中避免氣泡。
（3）孵育過程和清洗過程保持在搖床上輕搖。
（4）封閉、樣品孵育、*標(biāo)記抗體孵育、HRP-鏈霉親和素孵育的步驟可以4℃孵育過夜，但是請(qǐng)務(wù)必封閉芯片非常嚴(yán)密，以免液體蒸發(fā)。
四、檢測(cè)程序
1. 封閉和孵育
（1 ） 膜芯片帶有“-”標(biāo)志的面是印制有抗體的面，這個(gè)面朝上。當(dāng)同時(shí)操作多個(gè)膜的時(shí)候，可在膜的邊緣用圓珠筆標(biāo)記數(shù)字，以便分辨避免混亂。
（2）在孵育板中每個(gè)孔加入2 ml的1× 封閉緩沖液，用鑷子拖著膜或者夾著膜的邊緣將膜緩慢浸沒到封閉緩沖液中，有標(biāo)志的面朝上，避免氣泡產(chǎn)生，蓋上孵育板的蓋子，室溫振蕩孵育30 min。
（3）用抽液泵抽去每個(gè)孔的封閉液后，每張膜芯片加入1 ml樣品（或者1×封閉液稀釋好的樣品），蓋上蓋子，包上塑料薄膜，室溫振蕩孵育1-2小時(shí)（此步也可4℃過夜孵育）。
（4）抽去每個(gè)孔中的樣品，每孔加入2ml的1×洗液I清洗3次，每次5 min，室溫?fù)u床震蕩，每次清洗要抽干凈洗液，用去離子水稀釋20×洗液I。
注：避免相鄰孔中的液體流動(dòng)產(chǎn)生交叉污染。
（5）抽取每個(gè)孔中的1×洗液I，每孔加入2 ml的1×洗液II清洗2次，每次5 min，室溫?fù)u床震蕩，每次清洗要抽干凈洗液，用去離子水稀釋20×洗液II。
（6 ） 配制*標(biāo)記抗體，快速離心*標(biāo)記抗體的小管，加入100 µl的1×封閉液，混合均勻,再將管中所有的溶液加入到2 ml的1×封閉液中。
（7） 每個(gè)芯片上加入1 ml稀釋好的*標(biāo)記抗體，蓋上蓋子，包上塑料薄膜，室溫振蕩孵育1-2小時(shí)。
（8）清洗， 同3和4。
（9 ） 每張膜加入2 ml的1000倍稀釋的HRP-鏈霉親和素 （快速離心后，取2 µl的HRP-鏈霉親和素與998 µl的l×封閉液混合），蓋上蓋子，包上塑料薄膜，室溫振蕩孵育2小時(shí)（此步也可4℃過夜孵育）。
（10）清洗，同步驟3 和4。
2. 檢測(cè)
在整個(gè)檢測(cè)過程中膜不能干燥，且檢測(cè)過程在40 min內(nèi)完成.
（1）將500 µl檢測(cè)試劑C和500 µl檢測(cè)試劑D（用于2張膜的檢測(cè)）加入一支離心管中,混合均勻。將膜芯片從洗液II中撈出，夾在濾紙中去掉多余洗液后，轉(zhuǎn)移到一個(gè)干凈的孵育盒中，標(biāo)記面朝上，每張膜加入500 µl檢測(cè)混合液，室溫振蕩混合2 min，避免產(chǎn)生氣泡。
（2）用鑷子將膜從檢測(cè)液中撈出，輕輕放在一張塑料片上，帶有“-”標(biāo)記在左上角，緩慢蓋上另一張塑料片，驅(qū)趕氣泡，避免壓膜和反復(fù)摩擦，操作過程要盡快完成。
（3）膜芯片的信號(hào)可用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)或顯影儀器。
（4）化學(xué)發(fā)光成像儀可設(shè)置30 s、1 min、3 min、5 min連續(xù)拍照。
（5）如果使用膠片曝光，我們推薦使用Kodak X-Omat®AR膠片，x-ray膠片連續(xù)曝光。膜曝光40s，然后根據(jù)信號(hào)強(qiáng)度再次曝光，如果信號(hào)太強(qiáng)（背景很高），減少曝光時(shí)間（例如5-30秒），如果信號(hào)太弱，增加曝光時(shí)間（例如5-20min或者過夜）。
