RAPA3G動(dòng)物組織直擴(kuò)PCR試劑盒

RAPA3G DNA 聚合酶為經(jīng)電子重構(gòu)架的第三代 Taq DNA 聚合酶，第三代 DNA 聚合酶具有高度的雜質(zhì)耐受性、 長(zhǎng)片段擴(kuò)增能力、高擴(kuò)增成功率、高產(chǎn)量，這些特點(diǎn)使得 RAPA3G 系列產(chǎn)品可用于粗制樣品的直接擴(kuò)增，無(wú)需核酸純 化步驟。該 PCR Mix 具有 5’-3’的聚合酶活性、5’-3’的外切 酶活性、3’-5’的外切酶活性，產(chǎn)物部分帶有"A“尾巴，部 分為平末端，因此產(chǎn)物可用于 TA 克隆或平端克隆。

特點(diǎn)和用途：
（1）高雜質(zhì)耐受性：該 PCR Mix 可直接使用血液、蛋白含量較高的動(dòng)物組織材料進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，無(wú)需基因組提取。
（2）高效的快速 DNA 釋放劑：盡管該 PCR Mix 可以直接使用組織細(xì)胞材料進(jìn)行擴(kuò)增，但我們?nèi)匀煌扑]采用 DNA 釋放劑進(jìn)行樣本的快速前處理（約需要 5min，可高通量操作）。DNA 釋放劑的前處理，使得制備的 DNA 模板可以進(jìn)行多次、多基因擴(kuò)增，并長(zhǎng)期保存 DNA，經(jīng) DNA 釋放劑處理的樣本，在室溫條件下放置 1 個(gè)月，無(wú)任何后續(xù)影響，-20 可長(zhǎng)期保存。
（3）快速 PCR：該酶具有 6kb/min 以上的擴(kuò)增速度，可顯著的縮短 PCR 的擴(kuò)增時(shí)間，在常規(guī)測(cè)試條件下，10s 的延伸時(shí)間可完成 1kb 的基因組 DNA 擴(kuò)增。
（4）粗制樣品的擴(kuò)增能力：擴(kuò)增能力>4kb。
（5）高保真性能：該制品包含一定比例的 RAPA HiFi 超保真 DNA 聚合酶，因此其具有一定的保真性能（經(jīng)藍(lán)白斑測(cè)試，其保真性能約為 Taq DNA 聚合酶的 56 倍）。
（6）熱啟動(dòng)，防止非特異性擴(kuò)增：RAPA3G 系列產(chǎn)品均采用  專有的熱啟動(dòng)技術(shù)，確保 50 度以下無(wú)活性，僅有 95 度加熱 5min 以后才能恢復(fù)其活性，因此可限度的提高擴(kuò)增的特異性，減少非特異性產(chǎn)物的產(chǎn)生。
包裝：
2×RAPA3G PCR Mix (with Dye) 1ml×2
快速 DNA 釋放劑 A 20 ml
快速 DNA 釋放劑 B 20 ml
儲(chǔ)存：長(zhǎng)期儲(chǔ)存置于-20°C 以下，可保存 2 年；短期使用置于 4°C（3 個(gè)月）保存。
使用方法
1. DNA 釋放
（1）采用加熱法：取 2-10 個(gè)毛發(fā)囊、1-10mg 動(dòng)物組織等材料，放入到 0.2ml EP 管中，加入 50 μl 快速 DNA 釋放劑A，于 PCR 儀中 98°C 加熱 5min，加熱完畢后加入 50 μl快速 DNA 釋放劑 B，混合均勻，即可使用。
（2）采用鋼珠研磨法：取 1-10mg 動(dòng)物組織等材料，放入到 2ml EP 管中，加入 250 μl 快速 DNA 釋放劑 A 和 2-3 粒鋼珠，研磨 1-2min 成漿體裝。研磨完畢后加入 250 μl 快速DNA 釋放劑 B，混合均勻，即可使用。
2. 按下表配制 PCR 反應(yīng)體系并混合均勻：
2×RAPA3G PCR Mix (with Dye) 25 μl
上游引物(10 μM) 2 μl
下游引物(10 μM) 2 μl
步驟 1 制備的模板 DNA 2 μl
ddH2O 19 μl
注意：當(dāng)擴(kuò)增片段>5kb 時(shí)，引物用量調(diào)整為 0.25-0.5μl。
3. PCR 擴(kuò)增循環(huán)參數(shù)
循環(huán)數(shù) 溫度 時(shí)間
預(yù)變性 95°C 5min
25-40 Cycles
95°C 20s
50~60°C 20s
72°C 4-6kb/min
末延伸 72°C 2min
請(qǐng)注意：（1）該制品為熱啟動(dòng)制品預(yù)變性步驟 5min 不可縮短，否則 DNA 聚合酶無(wú)法恢復(fù)活性。（2）當(dāng)擴(kuò)增片段<1kb時(shí)，延伸時(shí)間使用 1-2kb="" 2-3kb="">3kb 時(shí)，請(qǐng)按照 2kb/min 的延伸時(shí)間進(jìn)行設(shè)置。(3)盡管該酶具有 6kb/min 的延伸速度，但按照 2kb/min 設(shè)置延伸時(shí)間的條件下，能獲得的產(chǎn)量。
3. 注意事項(xiàng)：(1) 當(dāng)模板 GC 含量>70%時(shí)，請(qǐng)?zhí)砑?× Q-Solution。(2)當(dāng)采用全血、血漿等蛋白含量的樣本時(shí)，擴(kuò)增完畢后可能會(huì)有變性的蛋白沉淀，請(qǐng)離心后再進(jìn)行點(diǎn)樣和電泳。

一、模板DNA：PCR反應(yīng)需要模板DNA，如從細(xì)胞、組織、血液中提取DNA等；

二、引物：PCR反應(yīng)的兩個(gè)引物，分別與模板DNA的兩端配對(duì)擴(kuò)增所需的特定區(qū)域，引物也可以合成為TA克隆等過(guò)程中使用到的引物；

三、dNTPs：PCR反應(yīng)中需要四種dNTPs，包括脫氧腺苷酸（dATP）、脫氧胸苷酸（dCTP）、脫氧鳥(niǎo)苷酸（dGTP）、脫氧胞嘧啶酸（dTTP），用于細(xì)胞分裂、DNA合成         等生物學(xué)過(guò)程，用于PCR擴(kuò)增的模板DNA鏈的延伸和擴(kuò)增；

四、Taq DNA聚合酶：PCR反應(yīng)需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，還有一些其他種類的聚合酶如PFU、Phusion等，用于擴(kuò)增DNA鏈；

五、PCR buffer溶液：對(duì)PCR反應(yīng)具有緩沖作用，調(diào)節(jié)反應(yīng)pH，硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機(jī)化合物如甲醛，可增強(qiáng)PCR反應(yīng)特異性，從而提高反應(yīng)效率；

六、酶切體系：PCR擴(kuò)增往往涉及到重組、構(gòu)建和測(cè)序等等實(shí)驗(yàn)步驟，常常需要進(jìn)行酶切操作。

七、MARK:一種分子量標(biāo)準(zhǔn)，用來(lái)判別DNA片段大小的工具。

八、DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物；

①Oligo dT
選擇Oligo dT時(shí)，要求RNA必須有Poly A，所以真核生物的mRNA都適用。適合長(zhǎng)鏈甚至全長(zhǎng)mRNA的RT，對(duì)RNA樣品的質(zhì)量要求較高，不要有明顯的DNA污染、RNA降解和RNA斷裂。假如想探索新的mRNA進(jìn)行RT反應(yīng)，建議推薦使用Oligo dT引物。使用Oligo dT引物要比隨機(jī)引物和特異性引物的穩(wěn)定性要好。
②隨機(jī)引物
適合各種RNA的RT，尤其適合模板豐度很低的情況（比如某個(gè)gene表達(dá)量很低）。選擇隨機(jī)引物時(shí)，鏈cDNA合成反應(yīng)中就是以所有的RNA為模板，然后進(jìn)行PCR反應(yīng)時(shí)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行特異性擴(kuò)增。同時(shí)要注意隨機(jī)引物的量和總RNA量之間的關(guān)系，一般建議每5µg總RNA的隨機(jī)引物的用量為50ng，如果每5µg總RNA的隨機(jī)引物的用量超過(guò)250ng，可能會(huì)導(dǎo)致小片段產(chǎn)物（＜500bp）的增加和長(zhǎng)片段、全長(zhǎng)產(chǎn)物的降低。
③特異性引物
基因特異性引物（GSP）是某個(gè)基因序列的一部分，與模板互補(bǔ)的引物。該引物需要結(jié)合目標(biāo)RNA的已知序列進(jìn)行設(shè)計(jì)。由于引物和RNA序列特異性結(jié)合，每個(gè)目標(biāo)RNA都需要一套新的基因特異性引物。因此，當(dāng)分析多種目標(biāo)時(shí)，則需要適用更多的RNA樣本。而且不同引物退火溫度本來(lái)就不相同，所以一般不推薦使用。如需要使用特異性引物，建議對(duì)退火溫度進(jìn)行優(yōu)化。