Benzonase 核酸酶

是來(lái)自經(jīng)基因工程改進(jìn)的核酸內(nèi)切酶。它能降解所有形式(包括單鏈，雙鏈，線性和環(huán)狀)的 DNA 和 RNA 而沒(méi)有蛋白裂解活性，在廣泛條件范圍具有很高的特異性。它將核酸消化成3-5 堿基長(zhǎng)度（雜交限度以下）的 5’-單磷酸寡核苷酸，從重級(jí)蛋白中去除核酸的操作，符合 FDA 關(guān)于核酸污染的處理規(guī)程。Benzonase 核酸酶迅速水解核酸的能力使該酶成為降低粘度以減少處理時(shí)間和增加蛋白產(chǎn)量的選擇。該酶與BacReady-Protein Extraction Solution和RIPA LysisBuffer 等蛋白抽提試劑配合使用，從而消除粗提物中的核酸，降低粘度。

單位定義：在 30 分鐘內(nèi)使△A260 值降低 1.0(相當(dāng)于消化 37 μg DNA )的酶量定義為一個(gè)活性單位。
應(yīng)用
蛋白提取時(shí)去除核酸污染
2D 凝膠電泳
Western Blot
IP- Western
儲(chǔ)存：置于-20°C 保存。
操作方法
1. 組織處理方法：將 30-50mg 動(dòng)植物組織研磨充分后，加入 100-200 μl RIPA 裂解液，同時(shí)加入 1 μlBenzonase 核酸酶，旋渦振蕩混合均勻，室溫孵育 30min。
2.細(xì)胞處理方法：將 106-107懸浮細(xì)胞液 6,000 rpm 離心10min 后，棄掉上清液，使用 100 μl RIPA 裂解液重懸細(xì)胞，同時(shí)加入 1μl Benzonase 核酸酶，旋渦振蕩混合均勻，室溫孵育 30min。注意：貼壁細(xì)胞重懸于 PBS 后，處理方法同懸浮細(xì)胞。
3. 大腸桿菌細(xì)胞處理：將 500 μl E.coli 培養(yǎng)液 8,000rpm 離心 5min 后，棄掉上清液，使用 100 μl 大腸桿菌裂解液重懸細(xì)胞，同時(shí)加入 1μl Benzonase 核酸酶，旋渦振蕩混合均勻，室溫孵育 30min。
4. 裂解步驟完成后，將裂解產(chǎn)物于 13,000 rpm 離心 10min后，取上清即為提取蛋白（包涵體蛋白留取沉淀為提取蛋白）。
5. 提取完蛋白后可利用 BCA 蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。

一、模板DNA：PCR反應(yīng)需要模板DNA，如從細(xì)胞、組織、血液中提取DNA等；

二、引物：PCR反應(yīng)的兩個(gè)引物，分別與模板DNA的兩端配對(duì)擴(kuò)增所需的特定區(qū)域，引物也可以合成為T(mén)A克隆等過(guò)程中使用到的引物；

三、dNTPs：PCR反應(yīng)中需要四種dNTPs，包括脫氧腺苷酸（dATP）、脫氧胸苷酸（dCTP）、脫氧鳥(niǎo)苷酸（dGTP）、脫氧胞嘧啶酸（dTTP），用于細(xì)胞分裂、DNA合成         等生物學(xué)過(guò)程，用于PCR擴(kuò)增的模板DNA鏈的延伸和擴(kuò)增；

四、Taq DNA聚合酶：PCR反應(yīng)需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，還有一些其他種類的聚合酶如PFU、Phusion等，用于擴(kuò)增DNA鏈；

五、PCR buffer溶液：對(duì)PCR反應(yīng)具有緩沖作用，調(diào)節(jié)反應(yīng)pH，硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機(jī)化合物如甲醛，可增強(qiáng)PCR反應(yīng)特異性，從而提高反應(yīng)效率；

六、酶切體系：PCR擴(kuò)增往往涉及到重組、構(gòu)建和測(cè)序等等實(shí)驗(yàn)步驟，常常需要進(jìn)行酶切操作。

七、MARK:一種分子量標(biāo)準(zhǔn)，用來(lái)判別DNA片段大小的工具。

八、DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物；

①Oligo dT
選擇Oligo dT時(shí)，要求RNA必須有Poly A，所以真核生物的mRNA都適用。適合長(zhǎng)鏈甚至全長(zhǎng)mRNA的RT，對(duì)RNA樣品的質(zhì)量要求較高，不要有明顯的DNA污染、RNA降解和RNA斷裂。假如想探索新的mRNA進(jìn)行RT反應(yīng)，建議推薦使用Oligo dT引物。使用Oligo dT引物要比隨機(jī)引物和特異性引物的穩(wěn)定性要好。
②隨機(jī)引物
適合各種RNA的RT，尤其適合模板豐度很低的情況（比如某個(gè)gene表達(dá)量很低）。選擇隨機(jī)引物時(shí)，鏈cDNA合成反應(yīng)中就是以所有的RNA為模板，然后進(jìn)行PCR反應(yīng)時(shí)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行特異性擴(kuò)增。同時(shí)要注意隨機(jī)引物的量和總RNA量之間的關(guān)系，一般建議每5µg總RNA的隨機(jī)引物的用量為50ng，如果每5µg總RNA的隨機(jī)引物的用量超過(guò)250ng，可能會(huì)導(dǎo)致小片段產(chǎn)物（＜500bp）的增加和長(zhǎng)片段、全長(zhǎng)產(chǎn)物的降低。
③特異性引物
基因特異性引物（GSP）是某個(gè)基因序列的一部分，與模板互補(bǔ)的引物。該引物需要結(jié)合目標(biāo)RNA的已知序列進(jìn)行設(shè)計(jì)。由于引物和RNA序列特異性結(jié)合，每個(gè)目標(biāo)RNA都需要一套新的基因特異性引物。因此，當(dāng)分析多種目標(biāo)時(shí)，則需要適用更多的RNA樣本。而且不同引物退火溫度本來(lái)就不相同，所以一般不推薦使用。如需要使用特異性引物，建議對(duì)退火溫度進(jìn)行優(yōu)化。