Gibson無縫克隆試劑盒

Gibson 無縫連接試劑盒是一種混合酶系統(tǒng)，其可將任意方法線性化的載體和與其兩端具有重疊區(qū)域的一個或多個 PCR 片段定向重組連接。該方法不依賴于 T4 DNA 連接酶，不受載體和目的片段的酶切位點限制，可在 30 分鐘內(nèi)實現(xiàn) PCR 片段高效定向無縫克隆至載體的任意位置，從而獲得完整的雙鏈 DNA 分子。該試劑盒使用簡單，只需加入合適比例的載體和 PCR 片段在室溫孵育 15-30min 即可完成片段的連接。
原理
T5 外切酶可從雙鏈 DNA5'端切割形成 3'突出末端， 從而促進(jìn)重疊區(qū)域的具有互補(bǔ)序列的片段進(jìn)行退火。高保真 DNA 聚合酶可使退火的片段向 3'端延伸，從而片段缺口。Taq DNA 連接酶可封閉缺刻從而獲得完整的雙鏈 DNA 分子。

優(yōu)勢
1. 室溫孵育即可完成片段的連接,無需 50℃。
2. 不受載體或插入片段酶切位點限制在任意位置進(jìn)行無縫克隆
3. 不依賴于 T4 連接酶，高效連接，無堿基缺失
4. 可同時高效連接一個或多個 PCR 片段
5. 無需額外的亞克隆，菌檢陽性率高達(dá) 95%
組分

保存
-20℃可保存 2 年，-80℃可保存 5 年，避免反復(fù)凍融。

一、模板DNA：PCR反應(yīng)需要模板DNA，如從細(xì)胞、組織、血液中提取DNA等；

二、引物：PCR反應(yīng)的兩個引物，分別與模板DNA的兩端配對擴(kuò)增所需的特定區(qū)域，引物也可以合成為TA克隆等過程中使用到的引物；

三、dNTPs：PCR反應(yīng)中需要四種dNTPs，包括脫氧腺苷酸（dATP）、脫氧胸苷酸（dCTP）、脫氧鳥苷酸（dGTP）、脫氧胞嘧啶酸（dTTP），用于細(xì)胞分裂、DNA合成         等生物學(xué)過程，用于PCR擴(kuò)增的模板DNA鏈的延伸和擴(kuò)增；

四、Taq DNA聚合酶：PCR反應(yīng)需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，還有一些其他種類的聚合酶如PFU、Phusion等，用于擴(kuò)增DNA鏈；

五、PCR buffer溶液：對PCR反應(yīng)具有緩沖作用，調(diào)節(jié)反應(yīng)pH，硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機(jī)化合物如甲醛，可增強(qiáng)PCR反應(yīng)特異性，從而提高反應(yīng)效率；

六、酶切體系：PCR擴(kuò)增往往涉及到重組、構(gòu)建和測序等等實驗步驟，常常需要進(jìn)行酶切操作。

七、MARK:一種分子量標(biāo)準(zhǔn)，用來判別DNA片段大小的工具。

八、DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物；

①Oligo dT
選擇Oligo dT時，要求RNA必須有Poly A，所以真核生物的mRNA都適用。適合長鏈甚至全長mRNA的RT，對RNA樣品的質(zhì)量要求較高，不要有明顯的DNA污染、RNA降解和RNA斷裂。假如想探索新的mRNA進(jìn)行RT反應(yīng)，建議推薦使用Oligo dT引物。使用Oligo dT引物要比隨機(jī)引物和特異性引物的穩(wěn)定性要好。
②隨機(jī)引物
適合各種RNA的RT，尤其適合模板豐度很低的情況（比如某個gene表達(dá)量很低）。選擇隨機(jī)引物時，鏈cDNA合成反應(yīng)中就是以所有的RNA為模板，然后進(jìn)行PCR反應(yīng)時設(shè)計引物進(jìn)行特異性擴(kuò)增。同時要注意隨機(jī)引物的量和總RNA量之間的關(guān)系，一般建議每5µg總RNA的隨機(jī)引物的用量為50ng，如果每5µg總RNA的隨機(jī)引物的用量超過250ng，可能會導(dǎo)致小片段產(chǎn)物（＜500bp）的增加和長片段、全長產(chǎn)物的降低。
③特異性引物
基因特異性引物（GSP）是某個基因序列的一部分，與模板互補(bǔ)的引物。該引物需要結(jié)合目標(biāo)RNA的已知序列進(jìn)行設(shè)計。由于引物和RNA序列特異性結(jié)合，每個目標(biāo)RNA都需要一套新的基因特異性引物。因此，當(dāng)分析多種目標(biāo)時，則需要適用更多的RNA樣本。而且不同引物退火溫度本來就不相同，所以一般不推薦使用。如需要使用特異性引物，建議對退火溫度進(jìn)行優(yōu)化。