UNG (Uracil N-Glycosylase)

niao嘧啶 DNA 糖基酶(Uracil N-Glycosylase,UNG)又名 Uracil-DNA Glycosylase, UDG, 來(lái)源于 E. coliuracil N-glycosylase 基因的重組表達(dá)，分子量為 26kDa。其可催化含niao嘧啶的單鏈和雙鏈 DNA 釋放游離niao嘧啶。
它對(duì) RNA 無(wú)活性，主要應(yīng)用于 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的防污染。
它的作用原理基于：如果在 PCR 反應(yīng)中以 dUTP 替代dTTP摻入DNA 中，形成了含 dU 堿基的 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物，該酶能選擇性斷裂單鏈和雙鏈 DNA 中 U 基的糖苷鍵，降解該 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物。

活性定義：在標(biāo)準(zhǔn) PCR 反應(yīng)體系下，37℃條件下，1 小時(shí)降解 1μg 含 dU 堿基的單鏈 DNA 的酶量為 1 活性單位。
反應(yīng) Buffer：UNG與絕大多數(shù)的PCR 聚合酶反應(yīng)緩沖液都是兼容的，但在高離子濃度(>100mM)下活性會(huì)受到抑制。
酶儲(chǔ)存液：20 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 1 mM DTT, , 50%Glycerol, 0.1% (w/v) Triton X-100, pH 7.5。
儲(chǔ)存：置于-20°C 可保存 2 年，避免反復(fù)凍融。
熱失活：95°C，5min。
操作方法
1.配制反應(yīng)體系
Super Taq DNA Polymerase 0.5 μl
dNTP/dUTP Mixture 2~4 μl
10XHi PCR Buffer 5 μl
Uracil N-Glycosylase (5U/μl) 0.2~0.5 μl
Primers (10μM each ) 1 μl
Template DNA 10 ng-1 μg
DEPC-treated Water up to 50 μl
2. PCR 擴(kuò)增循環(huán)參數(shù)
循環(huán)數(shù) 溫度 時(shí)間
去污染 50°C 2min
熱失活 95°C 5min
30-40 Cycles
95°C 20s
50~60°C 20s
72°C 1kb/1min
Last Cycle 72°C 5min

一、模板DNA：PCR反應(yīng)需要模板DNA，如從細(xì)胞、組織、血液中提取DNA等；

二、引物：PCR反應(yīng)的兩個(gè)引物，分別與模板DNA的兩端配對(duì)擴(kuò)增所需的特定區(qū)域，引物也可以合成為T(mén)A克隆等過(guò)程中使用到的引物；

三、dNTPs：PCR反應(yīng)中需要四種dNTPs，包括脫氧腺苷酸（dATP）、脫氧胸苷酸（dCTP）、脫氧鳥(niǎo)苷酸（dGTP）、脫氧胞嘧啶酸（dTTP），用于細(xì)胞分裂、DNA合成         等生物學(xué)過(guò)程，用于PCR擴(kuò)增的模板DNA鏈的延伸和擴(kuò)增；

四、Taq DNA聚合酶：PCR反應(yīng)需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，還有一些其他種類(lèi)的聚合酶如PFU、Phusion等，用于擴(kuò)增DNA鏈；

五、PCR buffer溶液：對(duì)PCR反應(yīng)具有緩沖作用，調(diào)節(jié)反應(yīng)pH，硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機(jī)化合物如甲醛，可增強(qiáng)PCR反應(yīng)特異性，從而提高反應(yīng)效率；

六、酶切體系：PCR擴(kuò)增往往涉及到重組、構(gòu)建和測(cè)序等等實(shí)驗(yàn)步驟，常常需要進(jìn)行酶切操作。

七、MARK:一種分子量標(biāo)準(zhǔn)，用來(lái)判別DNA片段大小的工具。

八、DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物；

①Oligo dT
選擇Oligo dT時(shí)，要求RNA必須有Poly A，所以真核生物的mRNA都適用。適合長(zhǎng)鏈甚至全長(zhǎng)mRNA的RT，對(duì)RNA樣品的質(zhì)量要求較高，不要有明顯的DNA污染、RNA降解和RNA斷裂。假如想探索新的mRNA進(jìn)行RT反應(yīng)，建議推薦使用Oligo dT引物。使用Oligo dT引物要比隨機(jī)引物和特異性引物的穩(wěn)定性要好。
②隨機(jī)引物
適合各種RNA的RT，尤其適合模板豐度很低的情況（比如某個(gè)gene表達(dá)量很低）。選擇隨機(jī)引物時(shí)，第鏈cDNA合成反應(yīng)中就是以所有的RNA為模板，然后進(jìn)行PCR反應(yīng)時(shí)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行特異性擴(kuò)增。同時(shí)要注意隨機(jī)引物的量和總RNA量之間的關(guān)系，一般建議每5µg總RNA的隨機(jī)引物的用量為50ng，如果每5µg總RNA的隨機(jī)引物的用量超過(guò)250ng，可能會(huì)導(dǎo)致小片段產(chǎn)物（＜500bp）的增加和長(zhǎng)片段、全長(zhǎng)產(chǎn)物的降低。
③特異性引物
基因特異性引物（GSP）是某個(gè)基因序列的一部分，與模板互補(bǔ)的引物。該引物需要結(jié)合目標(biāo)RNA的已知序列進(jìn)行設(shè)計(jì)。由于引物和RNA序列特異性結(jié)合，每個(gè)目標(biāo)RNA都需要一套新的基因特異性引物。因此，當(dāng)分析多種目標(biāo)時(shí)，則需要適用更多的RNA樣本。而且不同引物退火溫度本來(lái)就不相同，所以一般不推薦使用。如需要使用特異性引物，建議對(duì)退火溫度進(jìn)行優(yōu)化。