熱敏雙鏈DNA特異性核酸酶(HL dsDNase)

熱 敏 雙 鏈 DNA 特 異 性 核 酸 酶 (Heat labileds-DNA-specific Nuclease ，又名 ezDNase 或 HLdsDNase)，為雙鏈特異性核酸酶。其特異性的識別降解雙鏈 DNA，對單鏈 DNA 或 RNA 幾乎無活性，其降解 dsDNA的能力比 ssDNA 高~5000 倍。除此外，該酶降解雙鏈 DNA的能力比 bovine DNaseI 高~30 倍，因此特別適用于去除RNA 樣品中的基因組 DNA 污染。該熱敏型雙鏈 DNA 核酸酶可將 DNA 降解為 2~8bp 的產(chǎn)物，且 55℃ 5min 可使該酶不可逆失活，同時又能保持 RNA 和 ssDNA 的穩(wěn)定性。除此外，本酶適合于，對基因組樣品進(jìn)行酶法片段化反應(yīng)。

儲存：-20℃ 可保存 3 年。
活性定義： 1 單位指 25°C 條件下 15min 將 10μg 基因組DNA 消化至 80%的產(chǎn)物<500bp，所需的酶量。
使用注意事項
（1）1×dsDNase Buffer：20mM Tris-HCl pH8, 5mM MgCl2。該酶需要 1~5mM MgCl2。
（2）該酶對 K+敏感，反應(yīng)體系中推薦 K+濃度低于 40mM。
（3）通常在 RT 反應(yīng)中的用量為 0.1~0.5U/20 μl 體系。
（4）任何濃度的 SDS、鹽酸胍均抑制該酶活性。
（5）該酶的反應(yīng)溫度為 25~37℃，42℃ 30min 后活性損失 70%。
使用實例 1（對基因組 DNA 進(jìn)行片段化反應(yīng)）
1. 按以下組分配制反應(yīng)體系
基因組 DNA 10 μg
10×dsDNase Buffer 2.5 μl
HL dsDNase (2 U/μl) 0.5-1 μl
Rnase Free H2O Up to 25 μl
2. 室溫 25°C 孵育 15min，55~65°C 5min 加熱失活。
使用實例 2（基因組 DNA 的去除）
1. 按以下組分配制反應(yīng)體系
基因組 DNA 1 μg
10×dsDNase Buffer 2.5 μl
HL dsDNase (2 U/μl) 1 μl
Rnase Free H2O Up to 25 μl
2. 室溫 25°C 孵育 30min，55~65°C 5min 加熱失活。此時
基因組 DNA，通常 90%以上的產(chǎn)物被消化至<15bp

一、模板DNA：PCR反應(yīng)需要模板DNA，如從細(xì)胞、組織、血液中提取DNA等；

二、引物：PCR反應(yīng)的兩個引物，分別與模板DNA的兩端配對擴(kuò)增所需的特定區(qū)域，引物也可以合成為TA克隆等過程中使用到的引物；

三、dNTPs：PCR反應(yīng)中需要四種dNTPs，包括脫氧腺苷酸（dATP）、脫氧胸苷酸（dCTP）、脫氧鳥苷酸（dGTP）、脫氧胞嘧啶酸（dTTP），用于細(xì)胞分裂、DNA合成         等生物學(xué)過程，用于PCR擴(kuò)增的模板DNA鏈的延伸和擴(kuò)增；

四、Taq DNA聚合酶：PCR反應(yīng)需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，還有一些其他種類的聚合酶如PFU、Phusion等，用于擴(kuò)增DNA鏈；

五、PCR buffer溶液：對PCR反應(yīng)具有緩沖作用，調(diào)節(jié)反應(yīng)pH，硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機化合物如甲醛，可增強PCR反應(yīng)特異性，從而提高反應(yīng)效率；

六、酶切體系：PCR擴(kuò)增往往涉及到重組、構(gòu)建和測序等等實驗步驟，常常需要進(jìn)行酶切操作。

七、MARK:一種分子量標(biāo)準(zhǔn)，用來判別DNA片段大小的工具。

八、DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物；

①Oligo dT
選擇Oligo dT時，要求RNA必須有Poly A，所以真核生物的mRNA都適用。適合長鏈甚至全長mRNA的RT，對RNA樣品的質(zhì)量要求較高，不要有明顯的DNA污染、RNA降解和RNA斷裂。假如想探索新的mRNA進(jìn)行RT反應(yīng)，建議推薦使用Oligo dT引物。使用Oligo dT引物要比隨機引物和特異性引物的穩(wěn)定性要好。
②隨機引物
適合各種RNA的RT，尤其適合模板豐度很低的情況（比如某個gene表達(dá)量很低）。選擇隨機引物時，鏈cDNA合成反應(yīng)中就是以所有的RNA為模板，然后進(jìn)行PCR反應(yīng)時設(shè)計引物進(jìn)行特異性擴(kuò)增。同時要注意隨機引物的量和總RNA量之間的關(guān)系，一般建議每5µg總RNA的隨機引物的用量為50ng，如果每5µg總RNA的隨機引物的用量超過250ng，可能會導(dǎo)致小片段產(chǎn)物（＜500bp）的增加和長片段、全長產(chǎn)物的降低。
③特異性引物
基因特異性引物（GSP）是某個基因序列的一部分，與模板互補的引物。該引物需要結(jié)合目標(biāo)RNA的已知序列進(jìn)行設(shè)計。由于引物和RNA序列特異性結(jié)合，每個目標(biāo)RNA都需要一套新的基因特異性引物。因此，當(dāng)分析多種目標(biāo)時，則需要適用更多的RNA樣本。而且不同引物退火溫度本來就不相同，所以一般不推薦使用。如需要使用特異性引物，建議對退火溫度進(jìn)行優(yōu)化。