熒光定量PCR實驗步驟：
①取凍存已裂解的細(xì)胞，室溫放置5分鐘使其*溶解。
②兩相分離 每1ml的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2ml的lvfang，蓋緊管蓋。手動劇烈振蕩管體15秒后，15到30℃孵育2到3分鐘。4℃下12000rpm離心15分鐘。離心后混合液體將分為下層的紅色酚lvfang相，中間層以及無色水相上層。RNA全部被分配于水相中。水相上層的體積大約是勻漿時加入的TRIZOL試劑的60%。
③RNA沉淀 將水相上層轉(zhuǎn)移到一干凈無RNA酶的離心管中。加等體積異丙醇混合以沉淀其中的RNA，混勻后15到30℃孵育10分鐘后，于4℃下12000rpm 離心10分鐘。此時離心前不可見的RNA沉淀將在管底部和側(cè)壁上形成膠狀沉淀塊。
④RNA清洗 移去上清液，每1mlTRIZOL試劑裂解的樣品中加入至少1ml的75%乙醇(75%乙醇用DEPCH2O配制)，清洗RNA沉淀?；靹蚝?，4℃下7000rpm離心5分鐘。
⑤RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室溫空氣中干燥5-10分鐘。
⑥溶解RNA沉淀 溶解RNA時，先加入無RNA酶的水40μl用槍反復(fù)吹打幾次，使其*溶解，獲得的RNA溶液保存于-80℃待用。 1)紫外吸收法測定先用稀釋用的TE溶液將分光光度計調(diào)零。然后取少量RNA溶液用TE稀釋(1:100)后，讀取其在分光光度計260nm和280nm處的吸收值，測定RNA溶液 濃度和純度。

產(chǎn)品名稱：腰果源性成分探針法熒光定量PCR試劑盒
英文名稱：
貨號：XG01P4334
分類：熒光定量PCR試劑盒
儲存條件：-20℃避光保存，避免反復(fù)凍融。
運輸：低溫、避光，快遞免費送貨上門。

實時定量PCR：
①β-actin陽性模板的標(biāo)準(zhǔn)梯度制備 陽性模板的濃度為1011，反應(yīng)前取3μl按10倍稀釋（加水27μl并充分混勻）為1010，依次稀釋至109、108、107、106、105、104，以備用。
②反應(yīng)體系如下：
標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)體系
序號  反應(yīng)物  劑量
1   SYBR Green 1 染料  10μl
2  陽性模板上游引物F  0.5μl
3  陽性模板下游引物R  0.5μl
4  dNTP  0.5μl
5  Taq酶  1μl
6  陽性模板DNA  5μl
7  ddH2O  32.5μl
8  總體積  50μl
輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。

基因反應(yīng)體系：
序號  反應(yīng)物  劑量
1  SYBR Green 1 染料  10μl
2  內(nèi)參照上游引物F  0.5μl
3  內(nèi)參照下游引物R  0.5μl
4  dNTP  0.5μl
5  Taq酶  1μl
6  待測樣品cDNA  5μl
7  ddH2O  32.5μl
8  總體積  50μl
輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。
③制備好的陽性標(biāo)準(zhǔn)品和檢測樣本同時上機，反應(yīng)條件為：93℃　2分鐘，然后93℃ 1分鐘，55℃ 2分鐘，共40個循環(huán)。
PCR特異性：
1.primers design
這是重要的一步。理想的，只同目的序列兩側(cè)的單一序列而非其它序列退火的primer要符合下面一些條件：
1)足夠長，18～24bp，以保證特異性，當(dāng)然，不是說越長越好，太長的primer同樣會降低特異性，并且降低產(chǎn)量；
2)GC%，40%~60%；
3)5'端和中間序列要多GC，以增加穩(wěn)定性；
4)避免3'端GCrich，個BASE不要有GC，或者5個有3個不要是GC。
5)避免3'端的互補，否則，容易造成DIMER；
6)避免3'端的錯配；
7)避免內(nèi)部形成二級結(jié)構(gòu)；
8)附加序列(RT site，Promoter sequence)加到5'端，在算Tm值時不算，但在檢測互補和二級結(jié)構(gòu)要加上它們；
9)使用兼并primer時，要參考密碼子使用表，注意：生物偏好性，不要在3'端使用兼并primer，并使用較高的primer濃度(1μM～3μM)；
10)學(xué)會使用一種design software，PP5，Oligo6，DNA star，Vector NTI，Online design et al。

小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞英文名稱：raw264.7

小鼠肥大細(xì)胞細(xì)胞英文名稱：P815

小鼠白血病細(xì)胞G-CSF依賴性英文名稱：NFS-60

小鼠白血病細(xì)胞英文名稱：M1

大鼠肝細(xì)胞瘤細(xì)胞英文名稱：H-4-II-E

小鼠淋巴瘤細(xì)胞英文名稱：EL4.IL-2

小鼠結(jié)腸細(xì)胞英文名稱：CT-26 WT

小鼠垂體瘤細(xì)胞英文名稱：AtT20

EBTr (NBL-4) (牛胚氣管細(xì)胞)5×106cells/瓶×2

性別決定區(qū)Y框蛋白2(SOX2)重組蛋白英文名稱：Recombinant Sex Determining Region Y Box Protein 2 (SOX2)

單核細(xì)胞趨化蛋白2(MCP2)重組蛋白英文名稱：Recombinant Monocyte Chemotactic Protein 2 (MCP2)

哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基 規(guī)格： 250g 用途： 用于營養(yǎng)要求較高的細(xì)菌的培養(yǎng)及溶血試驗，還用于藥品中梭菌的檢測。(《中華人民共和國藥典》201...

人臍帶單核細(xì)胞*培養(yǎng)基100mL
腰果源性成分探針法熒光定量PCR試劑盒(S)-1-Boc-(3-Hydroxymethyl)pyrrolidine

(S)-1-Boc-3-氨甲基吡咯烷

(S)-1-Boc-3-氨甲基吡咯烷

3-甲氧基乙腈

3-甲氧基乙腈

3-甲氧基乙腈

2-氟-5-(三氟甲基)苯甲基

2-氟-5-(三氟甲基)苯甲基

2--4-氟

2--4-氟