PCR特異性：
1.primers design
這是重要的一步。理想的，只同目的序列兩側(cè)的單一序列而非其它序列退火的primer要符合下面一些條件：
1)足夠長，18～24bp，以保證特異性，當然，不是說越長越好，太長的primer同樣會降低特異性，并且降低產(chǎn)量；
2)GC%，40%~60%；
3)5'端和中間序列要多GC，以增加穩(wěn)定性；
4)避免3'端GCrich，個BASE不要有GC，或者5個有3個不要是GC。
5)避免3'端的互補，否則，容易造成DIMER；
6)避免3'端的錯配；
7)避免內(nèi)部形成二級結構；
8)附加序列(RT site，Promoter sequence)加到5'端，在算Tm值時不算，但在檢測互補和二級結構要加上它們；
9)使用兼并primer時，要參考密碼子使用表，注意：生物偏好性，不要在3'端使用兼并primer，并使用較高的primer濃度(1μM～3μM)；
10)學會使用一種design software，PP5，Oligo6，DNA star，Vector NTI，Online design et al。

產(chǎn)品名稱：綿羊痘病毒探針法熒光定量PCR試劑盒
英文名稱：Sheeppox Virus(SPPV)
貨號：XG01P4085
分類：熒光定量PCR試劑盒
儲存條件：-20℃避光保存，避免反復凍融。
運輸：低溫、避光，快遞免費送貨上門。

熒光定量PCR實驗步驟：
①取凍存已裂解的細胞，室溫放置5分鐘使其*溶解。
②兩相分離 每1ml的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2ml的lvfang，蓋緊管蓋。手動劇烈振蕩管體15秒后，15到30℃孵育2到3分鐘。4℃下12000rpm離心15分鐘。離心后混合液體將分為下層的紅色酚lvfang相，中間層以及無色水相上層。RNA全部被分配于水相中。水相上層的體積大約是勻漿時加入的TRIZOL試劑的60%。
③RNA沉淀 將水相上層轉(zhuǎn)移到一干凈無RNA酶的離心管中。加等體積異丙醇混合以沉淀其中的RNA，混勻后15到30℃孵育10分鐘后，于4℃下12000rpm 離心10分鐘。此時離心前不可見的RNA沉淀將在管底部和側(cè)壁上形成膠狀沉淀塊。
④RNA清洗 移去上清液，每1mlTRIZOL試劑裂解的樣品中加入至少1ml的75%乙醇(75%乙醇用DEPCH2O配制)，清洗RNA沉淀?；靹蚝?，4℃下7000rpm離心5分鐘。
⑤RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室溫空氣中干燥5-10分鐘。
⑥溶解RNA沉淀 溶解RNA時，先加入無RNA酶的水40μl用槍反復吹打幾次，使其*溶解，獲得的RNA溶液保存于-80℃待用。 1)紫外吸收法測定先用稀釋用的TE溶液將分光光度計調(diào)零。然后取少量RNA溶液用TE稀釋(1:100)后，讀取其在分光光度計260nm和280nm處的吸收值，測定RNA溶液 濃度和純度。
實時定量PCR：
①β-actin陽性模板的標準梯度制備 陽性模板的濃度為1011，反應前取3μl按10倍稀釋（加水27μl并充分混勻）為1010，依次稀釋至109、108、107、106、105、104，以備用。
②反應體系如下：
標準品反應體系
序號  反應物  劑量
1   SYBR Green 1 染料  10μl
2  陽性模板上游引物F  0.5μl
3  陽性模板下游引物R  0.5μl
4  dNTP  0.5μl
5  Taq酶  1μl
6  陽性模板DNA  5μl
7  ddH2O  32.5μl
8  總體積  50μl
輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。

大鼠淋巴成纖維細胞*培養(yǎng)基費氏中華根瘤菌 Sinorhizobium fredii

刺孢吸水鏈霉菌昆變種 Streptomyces hygrospinocus釀酒酵母 Saccharomyces cerevisiae

苜蓿中華根瘤菌黃芪黃酮

Hela S3(人宮頸細胞)小鼠皮層神經(jīng)膠質(zhì)細胞（EGFP標記）

大豆慢生根瘤菌 Bradyrhizobium japonicumJeKo-1(人套細胞淋巴瘤細胞)

銅綠假單胞菌 Pseudomonas aeruginosa酸球菌亞種 Lactococcus lactis subsp. lactis

大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞（高分化）中慢生華癸根瘤菌 Mesorhizobium huakuii

人宮內(nèi)膜腺細胞檸檬串珠菌 Leuconostoc citreum

熱帶假絲酵母 Candida tropicalis費氏中華根瘤菌 Sinorhizobium fredii

嗜熱鏈球菌 Streptococcus thermophilus釀酒酵母 Saccharomyces cerevisiae

CNE1, 人鼻咽細胞系人成巨核細胞白血病細胞

釀酒酵母 Saccharomyces cerevisiae人骨髓間充質(zhì)干細胞（hMSCs）

豇豆慢生根瘤菌 Bradyrhizobium vigna淡紫擬青霉 Paecilomyces lilacinus
綿羊痘病毒探針法熒光定量PCR試劑盒小鼠膀胱平滑肌細胞*培養(yǎng)基Cytomegaoviyns IgM antibody*96T

小鼠動脈內(nèi)皮細胞*培養(yǎng)基Brain derived neurotrophic facor上海直銷96T

小鼠動脈平滑肌細胞*培養(yǎng)基specific IgE4 against dust mite antibody*96T

小鼠小管上皮細胞*培養(yǎng)基His-Tag rabbit polyclonal現(xiàn)貨供應96T

小鼠小球內(nèi)皮細胞*培養(yǎng)基lupus anticoagulation*96T

小鼠前列腺上皮細胞*培養(yǎng)基specific IgG4 against dust mite antibody上海直銷96T

小鼠上皮細胞*培養(yǎng)基Ca-Mg-ATPase*96T

小鼠膀胱成纖維細胞*培養(yǎng)基uric acid transporter 1現(xiàn)貨供應96T

小鼠足突細胞*培養(yǎng)基short-chain fatty acids*96T

小鼠小管平滑肌細胞*培養(yǎng)基Medroxyprogesterone 17-acetate上海直銷96T

基因反應體系：
序號  反應物  劑量
1  SYBR Green 1 染料  10μl
2  內(nèi)參照上游引物F  0.5μl
3  內(nèi)參照下游引物R  0.5μl
4  dNTP  0.5μl
5  Taq酶  1μl
6  待測樣品cDNA  5μl
7  ddH2O  32.5μl
8  總體積  50μl
輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。
③制備好的陽性標準品和檢測樣本同時上機，反應條件為：93℃　2分鐘，然后93℃ 1分鐘，55℃ 2分鐘，共40個循環(huán)。