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聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)DNA體外復(fù)制條件分析

時間:2024/9/2閱讀:90
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  聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)是在體外進行的由引物介導(dǎo)的酶促DNA擴增反應(yīng)。PCR的原理是在模板DNA、PCR引物、四種脫氧核糖核苷酸(dNTP)及適當(dāng)濃度的Mg2+存在的條件下,依賴于DNA聚合酶的體外酶促合成反應(yīng)。  PCR是以DNA半保留復(fù)制機制為基礎(chǔ),發(fā)展出的體外酶促合成、擴增特定核酸片段的一種方法。
 
  一、模板和底物
 
  DNA復(fù)制是模板依賴性的,必須以親代DNA鏈作為模板,親代DNA的兩股鏈解開后,可分別作為模板進行復(fù)制。同時,DNA復(fù)制需要以四種脫氧核糖核苷酸,即dATP、dGTP、dCTP、dTTP,為底物合成子代DNA。
 
  在體外進行DNA復(fù)制時,模板和底物均可通過人工添加解決。
 
  二、引物
 
  DNA聚合酶必須以一段具有3’端自由羥基(3’-OH)的RNA作為引物,才能開始合成子代DNA鏈。
 
  在體外進行DNA復(fù)制時,可以人工合成具有特定序列的寡核苷酸作為引物,該引物序列與進行擴增的目的核酸片段互補匹配,從而開始目的片段的擴增。
 
  因為引物的堿基序列需要與目的片段相匹配,在合成引物之前,必須首先已知目的片段的堿基序列,至少也要知道目的片段的部分序列,從而確定合成引物的堿基序列。
 
  三、模板雙鏈的解旋
 
  在DNA的半保留復(fù)制機制中,雙鏈DNA的解旋是在拓撲異構(gòu)酶和解鏈酶的作用下完成的,該過程需要拓撲異構(gòu)酶識別DNA的復(fù)制起點才能開啟,而體外擴增特定的核酸片段只需要特異性的復(fù)制目的核酸片段,因而需要一種方式使得模板DNA解旋為單鏈DNA,之后在使之與引物結(jié)合,從而特異性的擴增目的核酸片段。
 
  三、DNA的變性
 
  DNA變性是指核酸雙螺旋結(jié)構(gòu)中堿基對的氫鍵斷裂,使得雙鏈變?yōu)閱捂湹倪^程。
 
  對雙鏈DNA進行加熱可以使其發(fā)生變性,當(dāng)溫度升高到一定高度時,DNA在260nm處的吸光度會突然發(fā)生明顯的上升,并達到最大值,之后溫度繼續(xù)上升,其吸光度也不會發(fā)生明顯變化,若以溫度對DNA溶液的260nm吸光度做圖,會得到典型的DNA變性S型曲線。
 
  DNA的變性是在一個很窄的溫度范圍內(nèi)發(fā)生的,通常將核酸加熱變性過程中,紫外光吸收值達到最大值50%時的溫度稱為核酸的熔解溫度 (Tm, melting temperature)。
 
  1. 特定核酸分子的Tm值與其G+C含量成正相關(guān),GC% = (Tm-69.3) × 2.44;
 
  2. Tm值的大小還與核酸分子的長度有關(guān),核酸分子越長,Tm值越大;
 
  3. 粒子強度越高,熔解溫度越高,熔解溫度范圍越窄。
 
  四、DNA的復(fù)性
 
  加熱變性的DNA在緩慢冷卻后可以由單鏈恢復(fù)為雙鏈結(jié)構(gòu),這一過程稱為DNA的復(fù)性,也稱為“退火 (annealing)"。
 
  當(dāng)溫度降低至比變性DNA的Tm低25℃時,其復(fù)性效果*佳,越遠離此溫度,復(fù)性效果越差。
 
  因此,可以利用此特性,在加熱使模板DNA變性后,將溫度降低至特定溫度,從而使所加引物與模板DNA復(fù)性結(jié)合,進而能夠?qū)σ锼?guī)定的核酸片段進行特異性的擴增。
 
  五、DNA聚合酶
 
  為了使模板中特定的核酸片段進行擴增,在模板與引物結(jié)合后,需要有DNA聚合酶的參與,但是由于DNA變性和復(fù)性過程的溫度較高,普通的DNA聚合酶在此過程中會由于溫度過高而失活。
 
  科學(xué)家為了解決該問題,從水生棲熱菌 (Thermus Aquaticus) 中分離出了具有熱穩(wěn)定性的DNA聚合酶,該酶可以耐受90℃以上的高溫而不失活。
 

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