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伊萊博生物科技（上海）有限公司
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更新時間：2025-06-26 15:23:26瀏覽次數(shù)：66
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一、cKO小鼠模型構(gòu)建技術(shù)路線選擇
方法 | 周期 | 適用場景 | 關(guān)鍵優(yōu)勢 |
CRISPR-Cas9 + HDR | 3-6個月 | 快速構(gòu)建floxed小鼠 | 無需ES細(xì)胞，直接受精卵操作 |
ES細(xì)胞同源重組 | 8-12個月 | 復(fù)雜設(shè)計(jì)（如大片段floxed） | 精準(zhǔn)度高，適合商業(yè)化品系開發(fā) |
Cre-loxP系統(tǒng) | 需兩代交配 | 組織特異性/誘導(dǎo)型敲除 | 時空可控性z強(qiáng) |
二、cKO小鼠模型構(gòu)建核心步驟詳解
1. 靶向策略設(shè)計(jì)
loxP位點(diǎn)插入：
選擇關(guān)鍵外顯子（通常第2-4號外顯子），兩側(cè)插入loxP序列（34 bp）。
設(shè)計(jì)原則：刪除后導(dǎo)致移碼突變或功能域缺失（需蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測）。
避免干擾：確保loxP不破壞相鄰基因的啟動子或增強(qiáng)子。
2. 打靶載體構(gòu)建（以ES細(xì)胞法為例）
5'同源臂 1.5-3kb
loxP
目標(biāo)外顯子
loxP
3'同源臂 1.5-3kb
NeoR篩選標(biāo)記
DTA負(fù)選標(biāo)記
3. 基因修飾小鼠制備
CRISPR法：
注射混合物：Cas9 mRNA + 2條sgRNA（靶向loxP插入位點(diǎn)） + ssDNA供體（含loxP序列）。
優(yōu)化要點(diǎn)：使用化學(xué)修飾的ssDNA供體提高HDR效率（如IDT的Ultramer）。
ES細(xì)胞法：
通過電轉(zhuǎn)將線性化載體轉(zhuǎn)入ES細(xì)胞，G418篩選后PCR驗(yàn)證正確重組克隆。
4. floxed小鼠鑒定
基因型檢測：
引物設(shè)計(jì)：
F1: 5'-同源臂外側(cè)
R1: loxP序列內(nèi)側(cè)
預(yù)期條帶：野生型（無loxP）和floxed（有loxP）差異≥100 bp。
測序驗(yàn)證：確保loxP方向正確（正向重復(fù)）。
5. 與Cre小鼠交配
Cre品系選擇：
Cre類型 | 代表品系 | 應(yīng)用 |
組織特異性 | Alb-Cre（肝臟） | 代謝研究 |
Nestin-Cre（神經(jīng)系統(tǒng)） | 神經(jīng)發(fā)育 | |
誘導(dǎo)型 | CAG-CreERT2（全身誘導(dǎo)） | 他mo昔芬給藥后敲除 |
發(fā)育階段特異性 | Sox2-Cre（早期胚胎） | 胚胎致死基因研究 |
交配策略：
自交
floxed/floxed
Cre陽性
F1: floxed/+ Cre+
F2: floxed/floxed Cre+
6. 敲除效率驗(yàn)證
qPCR/WB：比較Cre陽性和陰性組織的基因表達(dá)。
報告基因：若設(shè)計(jì)時引入tdTomato等，可直接熒光觀察。
三、常見問題解決方案
問題 | 原因 | 優(yōu)化策略 |
loxP重組失敗 | 同源臂太短或HDR效率低 | 延長同源臂至2 kb，使用HDR增強(qiáng)劑（如Rad51） |
背景敲除 | Cre滲漏表達(dá) | 選擇低滲漏Cre品系（如CreERT2） |
表型不一致 | 遺傳背景混雜 | 回交至純合背景（>N6） |
四、x技術(shù)升級
雙loxP系統(tǒng)（如lox2272）：實(shí)現(xiàn)可逆敲除，避免傳統(tǒng)loxP的不可逆性。
CRISPR-Cas9 + 轉(zhuǎn)座子：通過PB轉(zhuǎn)座子攜帶loxP，提高插入效率（適合難靶向位點(diǎn)）。
