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輔酶Ⅰ  NAD+/NADH含量試劑盒

輔酶Ⅰ  NAD+/NADH含量試劑盒

本試劑盒僅供科研使用 1 輔酶ⅠNAD+ / NADH 含量試劑盒說明書 【貨號：WS1080F 分光法 24 樣(可測 24 個 NAD+,24 個 NADH）】 一、產(chǎn)品簡介 煙*胺核苷酸的測定一直是細(xì)胞或組織在能量轉(zhuǎn)化和氧化還原狀態(tài)方面的研究熱點(diǎn)。 NAD+是糖酵解（EMP）和三羧酸循環(huán)（TCA）的主要?dú)涫荏w，其 NAD+/NADH 比值的 高低不僅可用于評價糖酵解和 TCA 循環(huán)的強(qiáng)弱，而且在生物物質(zhì)合成和抗氧化代謝中具 有重要調(diào)控作用。 本試劑盒提供一種方便，快速的檢測方法，提供特異性提取液分別提取樣品中的 NAD+ 和 NADH，NADH 在遞氫體作用下與一種高靈敏度的顯色劑反應(yīng)生成黃色水溶性甲瓚， 在 450nm 下檢測，得到 NADH 含量。利用乙醇脫氫酶特異性還原 NAD+為 NADH，從而 檢測 NAD+含量。 二、試劑盒組成和配制： 試劑名稱 規(guī)格 保存要求 備注 提取液A 液體30mL×1瓶 4℃保存 提取液B 液體30mL×1瓶 4℃保存 試劑一 液體μL×1支 -20℃保存 用前用1.6mL蒸餾水溶解備用 試劑二 液體μL×1支 -20℃保存 用前用1.9mL蒸餾水溶解備用 試劑三 液體30mL×1瓶 4℃保存 試劑四 液體1.5mL×1支 4℃保存 標(biāo)準(zhǔn)品 EP管×1支 -20℃保存 若重新做標(biāo)曲，則用到該試劑 三、所需的儀器和用品： 可見分光光度計、1mL 玻璃比色皿（光徑 1cm）、臺式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、研缽、 冰和蒸餾水。 四、輔酶ⅠNAD+ / NADH 含量測定： 建議正式實(shí)驗(yàn)前選取 2 個樣本做預(yù)測定，了解本批樣品情況，熟悉實(shí)驗(yàn)流程，避免實(shí)驗(yàn) 樣本和試劑浪費(fèi)！ 由于 NAD+ 和 NADH 很不穩(wěn)定，較易降解，盡量使用新鮮樣品進(jìn)行檢測。 1、樣本制備（制備完成的 NAD+ / NADH 待測上清液需盡快檢測，以免降解）： ① 組織中 NAD+和 NADH 的提取： NAD+的提取：取約 0.1g 組織（水分充足樣本可取 0.5g），加入 1mL 提取液 A，冰浴研磨， 全部轉(zhuǎn)移到 EP 管中（用提取液 A 補(bǔ)齊到 1mL），植物樣本于 95℃孵育 5min 或動物樣本 于 60℃孵育 30min，取出后立即冰?。ɑ蚍疟洌?/span>5min；12000rpm 4 ℃離心 10min；取 500μL 上清液至新 EP 管中，再加 V1 體積的提取液中和（可分次添加提取液 B，調(diào)至 PH 約中性，并記錄 V1）；12000rpm，4℃離心 5min，取上清液置于冰上待測。 NADH的提取：取約0.1g組織（水分充足樣本可取0.5g），加入1mL提取液B，冰浴研磨， 全部轉(zhuǎn)移到EP管中（用提取液B補(bǔ)齊到1mL），植物樣本于95℃孵育5min或動物樣本于60℃ 孵育30min，取出后立即冰?。ɑ蚍疟洌?/span>5min；12000rpm 4 ℃離心10min；取500μL上清 液至新EP管中，再加V2體積的提取液中和（可分次添加提取液A，調(diào)至PH約中性，并記 錄V2）；12000rpm，4 ℃離心5min，取上清液置于冰上待測。 【注】：若測出值較低，可加大樣本取樣量，如增加到 0.2g 等，可做幾個梯度選擇適合本次實(shí)驗(yàn)的樣本量。 ② 細(xì)胞或細(xì)菌中 NAD+和 NADH 的提取： NAD+的提取：先收集細(xì)胞或細(xì)菌到離心管內(nèi)：取約 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1ml 提取液 A， 冰浴研磨，全部轉(zhuǎn)移到 EP 管中（用提取液 A 補(bǔ)齊到 1mL），于 60℃孵育 30min，取出后本試劑盒僅供科研使用 2 立即冰浴（或放冰箱）5min；12000rpm 4℃離心 10min；取 500μL 上清液至新 EP 管中， 再加 V1 體積的提取液中和（可分次添加提取液 B，調(diào)至 PH 約中性，并記錄 V1）；12000rpm， 4℃離心 5min，取上清液置于冰上待測。 NADH 的提取：先收集細(xì)胞或細(xì)菌到離心管內(nèi)：取約 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取液 B，冰浴研磨，全部轉(zhuǎn)移到 EP 管中（用提取液 B 補(bǔ)齊 1mL），于 60℃孵育 30min，取出 后立即冰?。ɑ蚍疟洌?/span>5min；12000rpm 4 ℃離心 10min；取 500μL 上清液至新 EP 管中， 再加 V2 體積的提取液中和（可分次添加提取液 A，調(diào)至 PH 約中性，并記錄 V2）；12000rpm 4 ℃離心 5min，取上清置于冰上待測。 【注】：若測出值較低，可加大樣本取樣量，如增至 1000 萬等，可做幾個梯度選適合本次實(shí)驗(yàn)的樣本量。 ③ 液體中NAD+和NADH的提?。?NAD+的提取：取約 0.1mL 液體，加入 1mL 提取液 A，冰浴研磨，全部轉(zhuǎn)移到 EP 管中（用 提取液 A 補(bǔ)齊到 1.1mL），于 95℃孵育 5min，取出后立即冰浴（或放冰箱）5min；12000rpm 4 ℃離心 10min；取 500μL 上清液至新 EP 管中，再加 V1 體積的提取液中和（可分次添 加提取液 B，調(diào)至 PH 約中性，并記錄 V1）；12000rpm，4℃離心 5min，取上清液置于冰 上待測。 NADH的提取：取約0.1mL液體，加入1mL提取液B，冰浴研磨，全部轉(zhuǎn)移到EP管中（用 提取液B補(bǔ)齊到1.1mL），于95℃孵育5min，取出后立即冰?。ɑ蚍疟洌?/span>5min；12000rpm 4 ℃離心10min；取500μL上清液至新EP管中，再加V2體積的提取液中和（可分次添加提 取液A，調(diào)至PH約中性，并記錄V2）；12000rpm 4 ℃離心5min，取上清液置于冰上待測。 【注】：若測出值較低，可加大樣本取樣量，如增至 0.5mL 等，可做幾個梯度選擇適合本次實(shí)驗(yàn)的樣本量。 2、 上機(jī)檢測： 1 可見分光光度計預(yù)熱 30min 以上，溫度設(shè)定 37℃，調(diào)節(jié)波長至 450nm，蒸餾水調(diào)零。 2 在 1mL 玻璃比色皿中按下表依次加入試劑： 【注】：若ΔA 過小，可加大樣本取樣質(zhì)量 W；或增加樣本量 V1（由 70 增至 120μL，則試劑三相應(yīng)減少）， 或延長反應(yīng)時間（如：60min 或更長）；則改變后的相應(yīng)變量需代入計算公式重新計算。 五、結(jié)果計算： 1、標(biāo)準(zhǔn)曲線：y = 1.7682x - 0.0018：x 是 NADH 摩爾質(zhì)量（nmol），y 是ΔA。 試劑名稱（μL） 測定管 樣本 70 試劑一 35 試劑二 35 試劑三 530 37℃避光孵育 10min 試劑四 30 混勻， 37℃條件下，立即在 450nm 處測定吸光值 A1， 30min 后再測定 A2，ΔA=A2-A1。本試劑盒僅供科研使用 3 2、NAD+含量的計算： (1)按樣本鮮重計算： NAD+ (nmol/g 鮮重)=[(ΔA+0.0018)÷1.7682]÷(W÷2×V 樣÷V3) =16.16×(ΔA+0.0018)×(0.5+V1)÷W (2)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算： NAD+ (nmol/104 cell)=[(ΔA+0.0018)÷1.7682]÷(500÷2×V 樣÷V3) =0.032×(ΔA+0.0018)×(0.5+V1) (3)液體中 NAD+含量計算： NAD+含量(nmol/mL)=[(ΔA+0.0018)÷1.7682]÷(V 液÷2×V 樣÷V3) =161.6×(ΔA+0.0018)×(0.5+V1) 3、NADH 含量的計算： (1)按樣本鮮重計算： NADH (nmol/g 鮮重)=[(ΔA+0.0018)÷1.7682]÷(W÷2×V 樣÷V4) =16.16×(△A+0.0018)×(0.5+V2)÷W (2)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算： NADH (nmol/104 cell)=[(ΔA+0.0018)÷1.7682]÷(500÷2×V 樣÷V4) =0.032×(ΔA+0.0018)×(0.5+V2) (3)液體中 NADH 含量計算： NADH 含量(nmol/mL)=[(ΔA+0.0018)÷1.7682]÷(V 液÷2×V 樣÷V4) =161.6×(ΔA+0.0018)×(0.5+V2) V 樣---加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.07mL； V 液---所取液體樣本體積：0.1mL； V3---NAD+提取液體積：0.5mL 提取液 A+ V1mL 提取液 B=(0.5+V1)mL； V4---NADH 提取液體積：0.5mL 提取液 B+ V2mL 提取液 A=(0.5+V2)mL； W---樣本質(zhì)量，g； 500---細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500 萬； NADH 分子量---663.4； 附：標(biāo)準(zhǔn)曲線制作過程： 1 制備標(biāo)準(zhǔn)品母液（1μmol/mL）：向標(biāo)準(zhǔn)品 EP 管里面加入 1.41ml 蒸餾水（NADH 不 太穩(wěn)定，取出 NADH 后請盡快使用。如果發(fā)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不理想，很有可能是標(biāo)準(zhǔn)品 發(fā)生了降解）。 2 把母液稀釋成以下濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品：0，1，2，3，4，5，nmol/mL。也可根據(jù)實(shí) 際樣本來調(diào)整標(biāo)準(zhǔn)品濃度。 3 依據(jù)加樣表操作，根據(jù)結(jié)果即可制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。