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線粒體H+- ATP酶試劑盒

線粒體H+- ATP酶試劑盒

本試劑盒僅供科研使用 1 線粒體 H+ - ATP 酶活性測定說明書 （貨號：WS3680F 分光法 24 樣） 一、產品簡介： 線粒體是細胞呼吸代謝的重要場所，位于線粒體內膜的 H+ -ATP 酶是氧化磷酸化偶 聯(lián)的關鍵組分。H+ -ATP 酶可催化 ATP 水解生成 ADP 和無機磷，本試劑盒通過測定無 機磷的量來確定該酶活性高低。 二、試劑盒的組成和配制： 【注】：全程操作需無磷環(huán)境；試劑配置用新的槍頭和玻璃移液器等，也可以用一次性塑料器皿，避 免磷污染。 三、所需的儀器和用品： 可見分光光度計、1mL 玻璃比色皿（光徑 1cm）、水浴鍋、臺式離心機、可調式移液 器、研缽、冰和蒸餾水。 四、線粒體 H+ -ATP 酶活性檢測： 建議正式實驗前選取 2 個樣本做預測定，了解本批樣品情況，熟悉實驗流程，避免 實驗樣本和試劑浪費！ 1、線粒體制備（提示：整個線粒體的提取過程須保持 4℃低溫環(huán)境）： ① 稱取約 0.2g 組織或收集 1000 萬細菌/細胞，加入 1mL 提取液 1，用冰浴勻漿器或研 缽冰浴勻漿，轉移至離心管后于 4℃×3000g 離心 20min。 ② 小心吸取上清液（棄沉淀）移至另一離心管中，4℃×16000g 離心 20min。用移液器 移除上清液（上清液即為除去線粒體的胞漿蛋白，可用于測定從線粒體泄漏的 H+- ATP 酶（此步可選做））。留下沉淀（沉淀即為線粒體）。 ③ 在沉淀（線粒體）中加入 200μL 提取液 2，超聲波破碎（冰浴，功率 20％或 200W， 超聲 5s，間隔 3s，重復 30 次），液體置于冰上用于線粒體 H+ - ATP 酶活性測定。 【注】：若增加樣本量，可按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例進行提取，或按照 細菌/細胞數(shù)量（104）：提取液（mL）為 500~1000：1 的比例進行提取。 2、上機檢測： ① 可見分光光度計預熱 30min 以上，調節(jié)波長至 740nm，蒸餾水調零。 ② 所有試劑解凍至室溫（25℃）。 試劑名稱 規(guī)格 保存要求 備注 提取液 1 提取液 30mL×1 瓶 4℃保存 提取液 2 提取液 7mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 液體 14mL×1 瓶 4℃保存 試劑二 粉劑×1 支 4℃保存 用前甩幾下使試劑落入底部，再加 2mL 蒸餾水，混勻溶解備用。 試劑三 液體 3mL×1 支 4℃保存 試劑四 粉劑×1 支 4℃保存 用前甩幾下使試劑落入底部，再加 1.8mL 蒸餾水，混勻溶解備用。 試劑五 粉劑×1 支 -20℃保存 用前甩幾下使試劑落入底部，再加 0.7mL 蒸餾水，混勻溶解備用。 試劑六 液體 5mL×1 瓶 4℃保存 試劑七 A:粉體 mg×1 瓶 B:液體 2mL×1 瓶 4℃保存 臨用前加 1.8 mL 的 B 液，再加 23.2 mL 的蒸餾水，混勻溶解備用。 標準品 粉體 mg×1 支 4℃保存 若重新做標曲，則用到該試劑本試劑盒僅供科研使用 2 ③ 在 EP 管中依次加入： ④ 顯色反應，在 EP 管中依次加入： 五、結果計算： 1、標準曲線方程：y = 1.7406x - 0.0035，x 是標準品摩爾質量（μmol/mL）, y 是△A。 2、按蛋白濃度計算： 定義：每小時每毫克組織蛋白分解 ATP 產生 1μmol 無機磷的量為一個酶活力單位。 酶活力(μmol/h/mg prot)= [(△A+0.0035)÷1.7406×V2] ÷（V1×Cpr）÷T =13.36×(△A+0.0035)÷Cpr 3、按樣本鮮重計算： 定義：每小時每克組織分解 ATP 產生 1μmol 無機磷的量為一個酶活力單位。 酶活力(μmol/h/g 鮮重)= [(△A+0.0035)÷1.7406×V2]÷(W×V1÷V)÷T =13.36×(△A+0.0035)÷W 4、按細菌或細胞密度計算： 定義：每小時每 1 萬個細菌或細胞分解 ATP 產生 1μmol 無機磷的量為一個酶活力單位。 酶活力(μmol/h /104 cell)= [(△A+0.0035)÷1.7406×V2]÷(500×V1÷V)÷T =0.027×(△A+0.0035) 5、液體中酶活力計算: 定義：每小時每毫升液體分解 ATP 產生 1μmol 無機磷的量為一個酶活力單位。 酶活力（μmol/h/mL）= [(△A+0.0035)÷1.7406×V2]÷V1÷T=13.36×(△A+0.0035) 試劑名稱（μL） 測定管 對照管 試劑一 210 225 試劑二 30 30 試劑三 45 45 試劑四 30 30 樣本 60 60 混勻，靜置 5min 試劑五 15 混勻，37℃孵育 20min 試劑六 75 75 混勻，12000rpm，4℃離心 5min，上清液待測 上清液 300 300 試劑七 450 450 混勻，室溫靜置 15min，740nm 下讀取各管吸光值， △A=A 測定-A 對照（每個樣本做一個自身對照）。本試劑盒僅供科研使用 3 V---加入提取液體積，1mL； V1---加入樣本體積，0.06mL ； V2---酶促反應總體積，0.465mL； T---反應時間，1/3 小時； W---樣本鮮重，g； 500---細菌或細胞總數(shù)，500 萬。 Cpr---樣本蛋白質濃度，mg/mL；建議使用本公司的 BCA 蛋白含量檢測試劑盒。 附：標準曲線制作過程： 1 制備標準品母液（5μmol/mL）：標準品用 10mL 蒸餾水溶解。（母液需在兩天內用）。 2 把母液稀釋成六個濃度梯度的標準品：0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5μmol/mL。也可根據(jù)實 際樣本來調整標準品濃度。 3 依據(jù)顯色反應階段測定管的加樣體系操作，根據(jù)結果即可制作標準曲線。