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谷草天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶GOTAST試劑盒微板法

谷草天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶GOTAST試劑盒微板法

本試劑盒僅供科研使用 1 谷草轉(zhuǎn)氨酶/天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶(GOT/AST)試劑盒說明書 （貨號：WS4240W 微板法 96 樣） 一、產(chǎn)品簡介： 天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶，俗稱谷草轉(zhuǎn)氨酶，縮寫為 AST 或 GOT（EC 2.6.1.1）廣泛存在 于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，催化可逆轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)，是氨基酸代謝的重要酶。 谷草轉(zhuǎn)氨酶/天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶(GOT/AST)催化天門*氨酸和α-同戊二酸發(fā)生轉(zhuǎn)氨基 反應(yīng)，生成谷*酸和草酰乙酸，草酰乙酸進(jìn)一步自行脫羧生成丙酮酸；丙酮酸可與 2,4- 二硝基苯肼反應(yīng)生成 2,4-二硝基*腙，在堿性溶液中顯棕紅色；通過在 520nm 讀取吸光 值并計算出該酶活力大小。 二、試劑盒組成和配制： 試劑名稱 規(guī)格 保存要求 提取液 液體 100mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 液體 4mL×1 瓶 4℃保存 試劑二 液體 4mL×1 瓶 4℃保存 試劑三 液體 40mL×1 瓶 4℃保存 標(biāo)準(zhǔn)品 粉體 mg×1 支 4℃保存 三、所需的儀器和用品： 酶標(biāo)儀、96 孔板、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、臺式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、研缽。 四、谷草轉(zhuǎn)氨酶/天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶(GOT/AST)活性測定： 建議正式實驗前選取 2 個樣本做預(yù)測定，了解本批樣品情況，熟悉實驗流程，避免實驗 樣本和試劑浪費(fèi)！ 1、 樣本制備： ① 組織樣本： 取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液，進(jìn)行冰浴勻漿。12000rpm，4℃離心 10min，取上 清，置冰上待測。 【注】：若增加樣本量，可按照組織質(zhì)量(g):試劑一體積(mL)為 1:5~10 的比例提取。 ② 細(xì)菌/細(xì)胞樣本： 先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；取 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取液， 超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）；12000rpm， 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。 【注】：若增加樣本量，可按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量(104個):提取液體積(mL)為 500~1000:1 的比例提取。 ③ 血清（漿）樣本：直接檢測。若渾濁，離心后取上清檢測。 2、上機(jī)測定： ① 酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 520nm。 ② 可先做 2 個樣本預(yù)測定，熟悉操作過程，并依據(jù)測出的吸光值 A 是否超出標(biāo)準(zhǔn)曲線的 線性范圍來做調(diào)整。 3 在 96 孔板中依次加入： 試劑名稱（μL） 測定管 對照管 樣本 10 試劑一 20 20 混勻，于 37℃孵育 30min 試劑二 20 20 樣本 10本試劑盒僅供科研使用 2 混勻，于 37℃孵育 10min 試劑三 200 200 混勻，25℃孵育 10min，于 520nm 處測定吸光值 A， △A=A 測定-A 對照（每個樣本做一個自身對照）。 【注】1.若 A 測定超過 1.2，可降低樣本量 V1（如 5μL，另外 5μL 用蒸餾水補(bǔ)齊，總體積 10μL 保持 不變）。則改變后的加樣體積 V1 需代入計算公式重新計算。 2.若△A 的值在零附近徘徊，則可增加樣本量 V1（如 15μL，則試劑一相應(yīng)減少），或增加樣本 取樣質(zhì)量（W），則改變后的加樣體積 V1 和取樣質(zhì)量 W 需代入計算公式重新計算。 五、結(jié)果計算： 1、標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y = 0.4941x + 0.0039，x 為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（μmol/mL）；y 是ΔA。 2、按樣本蛋白濃度計算： 酶活定義：每毫克組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1 nmol 丙酮酸定義為一個酶活力單位。 GOT/AST(nmol/min/mg prot)=[(ΔA-0.0039)÷0.4941×V1]÷(V1×Cpr)÷T×103 =67.5×(ΔA-0.0039)÷Cpr 3、按樣本鮮重計算： 酶活定義：每克組織每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol 丙酮酸定義為一個酶活力單位。 GOT/AST(nmol/min/g 鮮重)=[(ΔA-0.0039)÷0.4941×V1]÷(W×V1÷V)÷T×103 =67.5×(ΔA-0.0039)÷W 4、按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算： 酶活定義：每 1 萬個細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol 丙酮酸定義為一個酶活力單位。 GOT/AST(nmol/min/104 cell)=[(ΔA-0.0039)÷0.4941×V1]÷(500×V1÷V)÷T×103 =0.135×(ΔA-0.0039) 5、血清（漿）GPT 活力計算： 酶活定義：每毫升血清（漿）每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol 丙酮酸定義為一個酶活力單位。 GOT/AST(nmol/min/mL)=[(ΔA-0.0039)÷0.4941×V1] ÷V1÷T×103=67.5×(ΔA-0.0039) V---提取液體積，1 mL； V1---反應(yīng)體系中樣本體積，0.01mL； T---反應(yīng)時間，30 min； W---樣本質(zhì)量，g； 500---細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500 萬； Cpr---樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL ；建議使用本公司 BCA 蛋白質(zhì)含量測定試劑盒。 附：標(biāo)準(zhǔn)曲線制作過程： 1 制備標(biāo)準(zhǔn)品母液（20μmol/mL）：加 1mL 蒸餾水溶解標(biāo)準(zhǔn)品，充分混勻。 2 把母液稀釋成以下濃度：0, 0.4, 0.8, 1.2, 1.6, 2μmol/mL。也可根據(jù)實際來調(diào)整濃度。 3 10μL 標(biāo)準(zhǔn)品+20μL 試劑一+20μL 試劑二，混勻，于 37℃孵育 10min ；再加 200μL 試劑三，混勻，25℃孵育 10min，于 520nm 處測定吸光值 A，依據(jù)結(jié)果即可制作標(biāo) 準(zhǔn)曲線。