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肉桂醇脫氫酶(CAD)試劑盒

肉桂醇脫氫酶(CAD)試劑盒

本試劑盒僅供科研使用 1 肉桂醇脫氫酶（ Cinnamyl-alcohol dehydrogenase，CAD)試劑盒說(shuō)明書(shū) （WS2001F 分光法 48 樣） 一、 產(chǎn)品簡(jiǎn)介： 肉桂醇脫氫酶(CAD，EC 1.1.1.195）是作為植物次生代謝特別是木質(zhì)素合成的關(guān)鍵酶, 與植物生長(zhǎng)發(fā)育和抵御病原菌入侵關(guān)系密切。本試劑盒提供一種簡(jiǎn)單，靈敏，快速的測(cè)定 方法：CAD 催化肉桂醇和 NADP+生成肉桂醛和 NADPH，進(jìn)而與特異的顯色劑反應(yīng)產(chǎn)生有 色物質(zhì)，通過(guò)檢測(cè)有有色物質(zhì)的增加速率，進(jìn)而計(jì)算出 CAD 酶活性的大小。 二、試劑盒組分與配制： 三、所需的儀器和用品： 可見(jiàn)分光光度計(jì)、1mL 玻璃比色皿（光徑 1cm）、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、研缽、冰 和蒸餾水。 四、肉桂醇脫氫酶（CAD）活性測(cè)定： 建議正式實(shí)驗(yàn)前選取 2 個(gè)樣本做預(yù)測(cè)定，了解本批樣品情況，熟悉實(shí)驗(yàn)流程，避免實(shí)驗(yàn) 樣本和試劑浪費(fèi)！ 1、樣本制備 ①組織樣本： 稱(chēng)取約 0.1g 組織（水分充足的果實(shí)樣本可取 0.5g），加入 1mL 提取液，進(jìn)行冰浴勻漿。 12000rpm 4℃離心 15min，取上清，置冰上待測(cè)。 【注】：若增加樣本量，可按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例提取 ②液體樣本：直接檢測(cè)。若渾濁，離心后取上清檢測(cè)。 2、 上機(jī)檢測(cè) ①可見(jiàn)分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上，溫度設(shè)定 37℃，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 450nm，蒸餾水調(diào)零。 ②試劑放在 37℃水浴 5min； ③按照下表在 1mL 玻璃比色皿中依次加入試劑： 【注】：若ΔA 在零附近徘徊，可延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間 T（如：40min 或更長(zhǎng)）， 或加大樣本量 V1（如增至 160μL，則試劑三相應(yīng)減少），重新 調(diào)整后的反應(yīng)時(shí)間 T 和 V1 需代入計(jì)算公式重新計(jì)算。 試劑名稱(chēng) 規(guī)格 保存要求 備注 提取液 液體 60mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 液體 10mL×1 瓶 4℃保存 試劑二 液體×1 支 4℃保存 試劑三 粉劑 mg×1 瓶 4℃保存 臨用前加入 28mL 提取液充分溶解，制備 成反應(yīng) mix；用不完的試劑 4℃保存; 標(biāo)準(zhǔn)品 粉劑 mg×1 支 4℃保存 若重新做標(biāo)曲，則用到該試劑 試劑名稱(chēng)（μL） 測(cè)定管 樣本 80 試劑一 160 試劑二 40 試劑三 520 混勻，立即 450nm 下讀取 A1 值，避光孵育 30min 后讀取 A2 值。ΔA=A2-A1。本試劑盒僅供科研使用 五、結(jié)果計(jì)算： 1、標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程：y = 2.4343x + 0.0074，x 是 NADPH 摩爾濃度：μmol/mL，y 是ΔA。 2、按樣本蛋白濃度計(jì)算： 單位的定義：在 37℃，每毫克組織蛋白每分鐘使 1 nmol 肉桂醇氧化成 1 nmol 肉桂醛并且 使 1 nmol NADP+轉(zhuǎn)換成 1 nmol NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。 CAD（nmol/min/mg prot）＝[(ΔA-0.0074)÷2.4343×V1×103]÷(V1×Cpr) ÷T =13.7×(ΔA-0.0074)÷Cpr 3、按樣本鮮重計(jì)算： 單位的定義：在 37℃，每毫克組織蛋白每分鐘使 1 nmol 肉桂醇氧化成 1 nmol 肉桂醛并且 使 1 nmol NADP+轉(zhuǎn)換成 1 nmol NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。 CAD（nmol/min/g 鮮重）＝[(ΔA-0.0074)÷2.4343×V1×103]÷(W ×V1÷V) ÷T =13.7×(ΔA-0.0074)÷W 4、液體樣本中 CAD 活力計(jì)算: 單位的定義：在 37℃，每毫克組織蛋白每分鐘使 1 nmol 肉桂醇氧化成 1 nmol 肉桂醛并且 使 1 nmol NADP+轉(zhuǎn)換成 1 nmol NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。 CAD（nmol/min /mL）＝[(ΔA-0.0074)÷2.4343×V1×103]÷V1÷T=13.7×(ΔA-0.0074) V---加入提取液體積，1 mL； V1---加入樣本體積，0.08 mL； T---反應(yīng)時(shí)間，30 min； W---樣本質(zhì)量，g； Cpr---樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；建議使用本公司的 BCA 蛋白含量檢測(cè)試劑盒。 附：標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制作過(guò)程： 1 制備標(biāo)準(zhǔn)品母液（0.5μmol /ml）：向標(biāo)準(zhǔn)品 EP 管里面加入 1.2ml 蒸餾水。 2 把母液稀釋成六個(gè)濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品：0, 0.1,0.2,0.3,0.4, 0.5.μmol/ml。也可根據(jù)實(shí)際 樣本來(lái)調(diào)整標(biāo)準(zhǔn)品濃度。 3 依據(jù)加樣表操作，根據(jù)結(jié)果即可制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。 2