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磷脂酶D(PLD)試劑盒

磷脂酶D(PLD)試劑盒

本試劑盒僅供科研使用 1 磷脂酶 D（Phospholipases D，PLD）活性測定試劑盒說明書 （貨號：WS5290F 分光法 24 樣） 一、產(chǎn)品簡介： 磷脂酶 D（EC 3.1.4.4）即磷脂酰*堿水解酶，是催化磷酸二酯鍵水解和堿基交換反應(yīng)的 一類酶的總稱，廣泛存在于高等動植物和細(xì)菌等多種生物體中，具有參與細(xì)胞脂質(zhì)代謝、 信號傳導(dǎo)、生物膜形成的抗逆境脅迫等生理功能。 磷脂酶 D 催化水解底物 O-(4-硝基苯基)*堿（NPPC），并在外加酸性磷酸酶的作用下產(chǎn) 生對硝基*酚(PNP)，該產(chǎn)物在 405nm 處有吸收峰。通過檢測 PNP 在 405nm 下的增加 速率，即可得到 PLC 酶活性大小。 二、試劑盒的組成和配制： 試劑名稱 規(guī)格 保存要求 備注 提取液 液體 30mL×1 瓶 4℃保存 用前搖勻再用。 試劑一 粉劑 mg×2 支 -20℃保存 用前甩幾下或離心使粉劑落入底 部，每支加 0.3mL 蒸餾水溶解備 用。用不完的試劑-20℃保存。 試劑二 粉劑 mg×1 支 -20℃保存 用前甩幾下使粉劑落入底部，加 1.2mL 蒸餾水溶解且 5000rpm 離 心 5min，取上清液備用。用不完 的上清液-20℃保存。 試劑三 液體 30mL×1 瓶 4℃保存 試劑四 液體 4mL×1 支 4℃保存 標(biāo)準(zhǔn)品 粉劑×1 支 4℃保存 若重新做標(biāo)曲，則用到該試劑。 三、所需的儀器和用品： 可見分光光度計(jì)、1mL 玻璃比色皿（光徑 1cm）、低溫離心機(jī)、水浴鍋或恒溫培養(yǎng)箱、 可調(diào)式移液器和蒸餾水。 四、磷脂酶 D（PLD）活性測定： 建議正式實(shí)驗(yàn)前選取 2 個樣本做預(yù)測定，了解本批樣品情況，熟悉實(shí)驗(yàn)流程，避免實(shí) 驗(yàn)樣本和試劑浪費(fèi)！ 1、樣本制備： ① 組織樣本：取約 0.1g 組織（水分充足的果實(shí)樣本可取 0.2-0.3g），加入 1mL 提取液（用 前搖勻再用），進(jìn)行冰浴勻漿，13000rpm，4℃離心 15min，取上清，置冰上待測。 【注】：若增加樣本量，可按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例提取。 ② 細(xì)菌/細(xì)胞樣本：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；取約 500 萬細(xì)菌或細(xì) 胞加入 1mL 提取液，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 200W，超聲 3s，間隔 10s， 重復(fù) 30 次）；13000rpm 4℃離心 15min，取上清，置冰上待測。 【注】：若增加樣本量，可按照細(xì)菌/細(xì)胞數(shù)量（104）：提取液（mL）為 500~1000：1 的比例進(jìn)行提取。 2、上機(jī)檢測： ① 可見分光光度計(jì)預(yù)熱 30min，調(diào)節(jié)波長到 405nm，蒸餾水調(diào)零。 ② 所有試劑解凍至室溫（25℃），在 EP 管中依次加入： 試劑名稱（μL） 測定管 對照管 樣本 105 105 試劑一 20 試劑二 20 20本試劑盒僅供科研使用 2 試劑三 485 505 混勻，37℃孵育反應(yīng) 30min。 試劑四 70 70 混勻，取全部液體至 1mL 玻璃比色皿（光徑 1cm）中， 于 405nm 處讀吸光值 A，△A=A 測定-A 對照(每個樣本 需做一個自身對照)。 【注】：① 若△A 的值小于 0.01，可增加樣本量 V1（如增至 60μL，則試劑三相應(yīng)減少）或延長反應(yīng)時 間 T（如增至 60min 或更長），則改變后的 V1 和 T 須代入公式重新計(jì)算。 ② 若△A 的值超過 1，可減少樣本量 V1（如減至 10μL，則試劑三相應(yīng)增加）或縮短反應(yīng)時間 T（如減至 10min）；或?qū)ψ罱K的待檢液用蒸餾水稀釋，則改變后的 V1 和 T 和稀釋倍數(shù) D 代入計(jì)算公式； 五、結(jié)果計(jì)算： 1、標(biāo)準(zhǔn)曲線：y = 0.0233x - 0.0109，x 是 PNP 摩爾質(zhì)量(nmol)，y 是△A。 2、按照樣本蛋白濃度計(jì)算： 酶活定義：37℃中每毫克蛋白每分鐘水解 1nmol NPPC 產(chǎn)生 PNP 定義為 1 個酶活單位。 PLD (nmol/min/mg prot)=[(ΔA+0.0109)÷0.0233]÷(Cpr×V1)÷T×D=13.6×(ΔA+0.0109)÷Cpr×D 3、按照樣本質(zhì)量計(jì)算： 酶活定義：37℃中每克組織每分鐘水解 1nmol NPPC 產(chǎn)生 PNP 定義為 1 個酶活單位。 PLD (nmol/min/g 鮮重)=[(ΔA+0.0109)÷0.0233]÷(W×V1÷V)÷T×D =13.6×(ΔA+0.0109)÷W×D 4、按細(xì)菌/細(xì)胞數(shù)量計(jì)算： 酶活定義：每 104個細(xì)胞每分鐘水解 1nmol NPPC 產(chǎn)生 PNP 定義為 1 個酶活單位。 PLD (nmol/min/104 cell)=[(ΔA+0.0109)÷0.0233]÷(500×V1÷V)÷T×D=0.03×(ΔA+0.0109)×D 5、按液體體積計(jì)算： 酶活定義：37℃中每毫升液體每分鐘水解 1nmol NPPC 產(chǎn)生 PNP 定義為 1 個酶活單位。 PLD (nmol/min/mL)=[(ΔA+0.0109)÷0.0233]÷V1÷T×D=13.6×(ΔA+0.0109)×D V---提取液體積，1 mL； V1---加入反應(yīng)體系中上清液體積（mL），0.105mL； T---反應(yīng)時間（min），30 min； D---稀釋倍數(shù)，未稀釋即為 1； W ---樣品質(zhì)量，g； 500---細(xì)胞數(shù)量； Cpr---粗酶液蛋白質(zhì)濃度（mg/mL），建議使用本公司的 BCA 蛋白質(zhì)含量測定試劑盒； 附：標(biāo)準(zhǔn)曲線制作過程： 1 制備標(biāo)準(zhǔn)品母液（10μmol/mL）：向標(biāo)準(zhǔn)品 EP 管里面加入 1.4ml 蒸餾水超聲溶解。 2 把母液用蒸餾水稀釋成以下濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品：0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5 μmol/mL。也 可根據(jù)實(shí)際樣本來調(diào)整標(biāo)準(zhǔn)品濃度。 3 在 EP 管中依次加入：105μL 標(biāo)準(zhǔn)品+525μL 試劑三+70μL 試劑四，混勻取全部液體 至 1mL 玻璃比色皿（光徑 1cm）中，于 405nm 處讀值，根據(jù)結(jié)果即可制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。