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甘油激酶（GK）活性試劑盒

甘油激酶（GK）活性試劑盒

本試劑盒僅供科研使用 1 甘油激酶（GK）活性測(cè)定試劑盒說明書 （貨號(hào)：WS9190F 分光法 48 樣） 一、產(chǎn)品簡(jiǎn)介： 甘油激酶（GK，EC 2.7.1.30）是甘油代謝中的限速酶，催化甘油磷酸化產(chǎn)生 3-磷酸甘 油，3-磷酸甘油在 3-磷酸甘油脫氫酶的作用下產(chǎn)生磷酸二羥丙酮，進(jìn)入糖酵解途徑氧化分 解釋放能量。該酶的缺乏將直接導(dǎo)致細(xì)胞不能利用甘油。 本試劑盒采用甘油激酶催化 Mg-ATP 依賴的甘油磷酸化為 3-磷酸甘油，3-磷酸甘油在 磷酸甘油氧化酶的作用下產(chǎn)生過氧化氫，過氧化氫與顯色劑反應(yīng)在 510nm 處有吸收 峰。通過測(cè)定 510nm 處的增加速率即可得出甘油激酶的酶活力大小。 二、試劑盒組成和配制： 試劑名稱 規(guī)格 保存要求 備注 提取液 液體 60mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 粉劑 mg×1 支 -20℃保存 用前甩幾下或離心使粉劑落入底 部，臨用前加 1.1mL 蒸餾水溶解 備用。用不完的試劑 4℃保存。 試劑二 粉劑 mg×1 支 -20℃保存 用前甩幾下或離心使粉劑落入底 部，臨用前加 2.2mL 蒸餾水溶解 備用。用不完的試劑 4℃保存。 試劑三 液體 12mL×1 瓶 4℃保存 試劑四 液體 20mL×1 瓶 4℃保存 試劑五 液體 mL×1 支 4℃保存 用前甩幾下或離心使試劑落入底 部，臨用前加 4.4mL 蒸餾水溶解 備用。用不完的試劑 4℃保存。 標(biāo)準(zhǔn)品 液體 1 mL×1 支 4℃保存 若重新做標(biāo)曲，則用到該試劑 三、所需的儀器和用品： 可見分光光度計(jì)、1mL 的玻璃比色皿（光徑 1cm）、可調(diào)試移液器、臺(tái)式離心機(jī)、水 浴鍋、研缽、冰和蒸餾水。 四、甘油激酶（GK）活性測(cè)定： 建議正式實(shí)驗(yàn)前選取 2 個(gè)樣本做預(yù)測(cè)定，了解本批樣品情況，熟悉實(shí)驗(yàn)流程，避免實(shí) 驗(yàn)樣本和試劑浪費(fèi)！ 1、樣本制備： ① 組織樣本：取約 0.1g 組織（水分充足的樣本可取 0.5g）到研缽內(nèi)，加入 1mL 提取液， 在冰上進(jìn)行冰浴勻漿或者液氮研磨。12000rpm，4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。 【注】：也可以按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例提取。 ② 細(xì)菌/真菌樣本：先收集細(xì)菌/真菌到離心管內(nèi)，離心后棄上清；取 500 萬細(xì)菌/真菌加 入 1mL 提取液；冰浴超聲波破碎細(xì)菌/真菌（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間 隔 10s，重復(fù) 30 次）；12000rpm，4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。 【注】：也可按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例進(jìn)行提取。 ③ 液體樣本：澄清的液體樣本直接檢測(cè)，若渾濁則離心后取上清液檢測(cè)。 2、上機(jī)檢測(cè)： ① 可見分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 510nm，蒸餾水調(diào)零。 ② 在 1mL 的玻璃比色皿（光徑 1cm）中依次加入下列試劑：本試劑盒僅供科研使用 2 試劑名稱（μL） 測(cè)定管 樣本 40 試劑一 20 試劑二 40 試劑三 240 試劑四 380 混勻，37℃避光靜止 5min。 試劑五 80 混勻，37℃下，立即于 510nm 讀取吸光值 A1，室溫孵育 5min 后讀取 A2。ΔA=A2-A1。 【注】：加完試劑五即啟動(dòng)反應(yīng)，所以試劑五加完需立即混勻檢測(cè)，若ΔA 小于 0.05，可增加樣本上樣 量 V1，試劑四相應(yīng)減少保持原體系不變（如樣本上樣量為 80μL 時(shí)，試劑四為 340μL）。或延 長反應(yīng)時(shí)間 T（如延長至 10min 或更長），則改變后的 V1 和 T 需帶入計(jì)算公式重新計(jì)算。 五、結(jié)果計(jì)算： 1、標(biāo)準(zhǔn)曲線：y =0.1326x - 0.0041：x 為 H2O2標(biāo)準(zhǔn)品濃度(μmoL/mL)，y 為ΔA。 2、按樣本鮮重計(jì)算： 酶活定義：每克組織每分鐘催化生成 1μmoLH2O2 定義為一個(gè)酶活單位（U）。 GK(μmoL/min/g 鮮重)=[(ΔA+0.0041)÷0.1326×V1]÷(W×V1÷V)÷T =1.51×(ΔA+0.0041)÷W 3、按樣本蛋白濃度計(jì)算： 酶活定義：每毫克組織蛋白每分鐘催化生成 1μmoLH2O2 定義為一個(gè)酶活單位（U）。 GK(μmoL/min/mg prot)=[(ΔA+0.0041)÷0.1326×V1]÷(V1×Cpr)÷T=1.51×(ΔA+0.0041)÷Cpr 3、按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算： 酶活定義：每 104個(gè)細(xì)胞每分鐘催化生成 1μmoLH2O2 定義為一個(gè)酶活單位（U）。 GK(μmoL/min/104cell)=[(ΔA+0.0041)÷0.1326×V1]÷(500×V1÷V)÷T=0.003×(ΔA+0.0041) 4、按液體體積計(jì)算： 酶活定義：每毫升液體每分鐘催化生成 1μmoLH2O2 定義為一個(gè)酶活單位（U）。 GK(μmoL/min/mL)=[(ΔA+0.0041)÷0.1326×V1]÷V1÷T=1.51×(ΔA+0.0041) V---加入提取液體積，1 mL； V1---加入樣本體積，0.04mL； T---反應(yīng)時(shí)間，5 min； W---樣本質(zhì)量； 500---細(xì)胞數(shù)量； Cpr---樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；建議使用本公司的蛋白含量測(cè)定試劑盒。 附：標(biāo)準(zhǔn)曲線制作過程： 1. 用蒸餾水把母液（250mM）稀釋成以下濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品：0,2,4,6,8,10mM。也可根 據(jù)實(shí)際情況來調(diào)整標(biāo)準(zhǔn)品濃度。 2. 按照測(cè)定管（樣本替換為標(biāo)準(zhǔn)品）加樣體系操作，依據(jù)結(jié)果即可制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。