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蔗糖合成酶SS-Ⅱ(合成方向)試劑盒

蔗糖合成酶SS-Ⅱ(合成方向)試劑盒

本試劑盒僅供科研使用 1 蔗糖合成酶（合成方向；SS-Ⅱ）試劑盒說(shuō)明書(shū) （貨號(hào)：WS2150F 分光法 24 樣） 一、產(chǎn)品簡(jiǎn)介： 蔗糖是重要的光合產(chǎn)物，是植物體內(nèi)運(yùn)輸?shù)闹饕镔|(zhì)，優(yōu)勢(shì)碳水化合物的暫貯形式之一。 蔗糖合成酶（Sucrose Synthase，EC 2.4.1.13）是雙向反應(yīng)酶，既可催化蔗糖合成又可催化 蔗糖分解，是蔗糖代謝的關(guān)鍵酶之一。研究其合成方向 SS-Ⅱ的活性對(duì)于植物蔗糖合成具 有重要意義。 SS-Ⅱ催化游離果糖與葡萄糖供體 UDPG 反應(yīng)生成蔗糖，采用蔗糖與間苯*fen反應(yīng)生成 的有顏色產(chǎn)物在 480nm 下有特征吸收峰，酶活力大小與顏色深淺成正比。 二、試劑盒的組成和配制： 試劑名稱(chēng) 規(guī)格 保存要求 備注 提取液 液體 30 mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 液體 2.1 mL×1 支 -20℃保存 試劑二 液體 1mL×1 支 4℃保存 試劑三 液體 20 mL×1 瓶 4℃保存 試劑四 粉劑 mg×2 瓶 4℃保存 臨用前甩幾下使粉劑落入底部，每 瓶加入 4mL 蒸餾水充分溶解，現(xiàn)配 現(xiàn)用，一周內(nèi)用完。 標(biāo)準(zhǔn)品 粉劑 mg×1 支 4℃保存 若重新做標(biāo)曲，則用到該試劑 三、所需的儀器和用品： 可見(jiàn)分光光度計(jì)、1 mL 玻璃比色皿（光徑 1cm）、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、移液器、研缽。 四、蔗糖合成酶（SS-Ⅱ）活性測(cè)定： 建議正式實(shí)驗(yàn)前選取 2 個(gè)樣本做預(yù)測(cè)定，了解本批樣品情況，熟悉實(shí)驗(yàn)流程，避免實(shí)驗(yàn) 樣本和試劑浪費(fèi)！ 1、樣本制備： ① 組織樣本： 稱(chēng)取約 0.1g 組織（水分充足樣本可取 0.5g），加 1mL 提取液，在 4oC 或冰浴進(jìn)行勻 漿(或使用各類(lèi)常見(jiàn)電動(dòng)勻漿器)。4oC 約 12,000rpm 離心 10min，取上清作為待測(cè)樣品。 【注意】 若樣本含糖量高，可引起 A 對(duì)照值較大如超過(guò) 1.6，即檢測(cè)背景值過(guò)高會(huì)影響檢測(cè)，可在樣本 制備過(guò)程中增加除糖步驟：取約 0.1g 組織（水分充足的樣本可取 0.5g），加入 1mL 經(jīng)預(yù)冷的 95%乙醇 冰浴勻漿，4℃放置 10min；12000rpm，4℃離心 5min；棄上清，留沉淀，向沉淀中加入經(jīng)預(yù)冷的 80% 乙醇混勻，4℃放置 5min；12000rpm，4℃離心 5min；棄上清，留沉淀。再向沉淀中加入 1mL 經(jīng)預(yù)冷 提取液渦旋混勻，4℃放置 10min；12000rpm，4℃離心 10min；留上清，棄沉淀。上清液置冰上待測(cè)。 ② 液體樣本：直接測(cè)定。若渾濁，離心后取上清檢測(cè)。 2、 上機(jī)檢測(cè)： ① 分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 480nm，蒸餾水調(diào)零。 ② 在 EP 管中依次加入： 試劑名稱(chēng)（μL） 測(cè)定管 對(duì)照管 試劑一 80 蒸餾水 80 樣本 40 40 37℃水浴 20min本試劑盒僅供科研使用 2 試劑二 20 20 試劑二需直接加到反應(yīng)液里面，且務(wù)必混勻（可用槍頭吸 打），95℃水浴中煮沸 10min（可用封口膜纏緊，防止水分 散失），冷卻至室溫。 試劑三 400 400 試劑四 120 120 混勻，95℃水浴 20min，冷卻后，取全部液體至 1 mL 玻 璃比色皿（光徑 1cm）中，480nm 下測(cè)定。ΔA=A 測(cè)定管 -A 對(duì)照管（每個(gè)測(cè)定管需設(shè)一個(gè)對(duì)照管）。 【注】：若ΔA 值過(guò)小如在零附近徘徊，可延長(zhǎng) 37℃水浴時(shí)間 T（如 40min 或更長(zhǎng)），或增加樣本取 樣量 W（如增至 0.2g），或增加樣本的加樣體積 V1（如 60μL，則試劑三相應(yīng)減少），相應(yīng)的 變量重新代入計(jì)算公式計(jì)算。 五、結(jié)果計(jì)算： 1、標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)：y = 0.0042x - 0.0016；x 為蔗糖標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量（μg），y 為ΔA。 2、按照蛋白濃度計(jì)算： 單位定義：每毫克組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1μg 蔗糖定義為一個(gè)酶活力單位。 SS-Ⅱ活性(μg /min/mg prot)=[(ΔA+0.0016) ÷0.0042]÷(V1×Cpr) ÷T =297.6×(ΔA+0.0016)÷Cpr×D 3、按照樣本鮮重計(jì)算： 單位定義：每克組織每分鐘催化產(chǎn)生 1μg 蔗糖定義為一個(gè)酶活力單位。 SS-Ⅱ活性(μg/min/g 鮮重)=[(ΔA+0.0016) ÷0.0042]÷(W×V1÷V) ÷T =297.6×(ΔA+0.0016)÷W 4、按照液體體積計(jì)算： 單位定義：每毫升液體每分鐘催化產(chǎn)生 1μg 蔗糖定義為一個(gè)酶活力單位。 SS-Ⅱ活性(μg/min/mL)=[(ΔA+0.0016) ÷0.0042]÷V1÷T=297.6×(ΔA+0.0016) V---加入提取液體積，1 mL； V1---加入樣本體積，0.04mL； T---反應(yīng)時(shí)間，20 min； W---樣本質(zhì)量，g； Cpr---樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；建議使用本公司的 BCA 蛋白含量檢測(cè)試劑盒； 附：標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制作過(guò)程： 1 制備標(biāo)準(zhǔn)品母液（10mg/mL）：向標(biāo)準(zhǔn)品 EP 管里面加入 1mL 蒸餾水（母液需在兩天 內(nèi)用且-20℃保存）。 2 把母液稀釋成六個(gè)濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品：0, 1.6, 3.2, 4.8, 6.4, 8. mg/mL。也可根據(jù)實(shí)際 樣本來(lái)調(diào)整標(biāo)準(zhǔn)品濃度。 3 按照：40μL 標(biāo)準(zhǔn)品+80μL 蒸餾水+20μL 試劑二+400μL 試劑三+120μL 試劑四，依次 加樣操作，95℃水浴 20min，冷卻后，取全部液體至 1 mL 玻璃比色皿（光徑 1cm） 中，480nm 下測(cè)定，根據(jù)結(jié)果即可制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。