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蔗糖磷酸合成酶(SPS)試劑盒

蔗糖磷酸合成酶(SPS)試劑盒

本試劑盒僅供科研使用 1 蔗糖磷酸合成酶（Sucrose phosphate synthase，SPS）試劑盒說(shuō)明書(shū) （貨號(hào)：WS5150F 分光法 24 樣） 一、產(chǎn)品簡(jiǎn)介： 蔗糖磷酸合成酶（EC 2.4.1.14）主要存在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育，是植物體 內(nèi)催化蔗糖合成的關(guān)鍵酶之一。蔗糖磷酸合成酶催化果糖-6-磷酸形成蔗糖磷酸，蔗糖 磷酸與間苯*fen反應(yīng)生成有色物質(zhì)，在 480nm 下有特征吸收峰，酶活力大小與顏色的 深淺成正比。 二、試劑盒組成和配制： 試劑名稱 規(guī)格 保存要求 備注 提取液 液體 30mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 液體 2.1mL×1 支 -20℃保存 試劑二 液體 1mL×1 支 4℃保存 試劑三 液體 20mL×1 瓶 4℃保存 試劑四 粉劑 mg×2 瓶 4℃保存 臨用前甩幾下使粉劑落入底部， 每瓶加入 4mL 蒸餾水充分溶解， 現(xiàn)配現(xiàn)用，一周內(nèi)用完。 標(biāo)準(zhǔn)品 粉劑 mg×1 支 4℃保存 若重新做標(biāo)曲，則用到該試劑 三、所需儀器和用品： 可見(jiàn)分光光度計(jì)、1mL 玻璃比色皿（光徑 1cm）、水浴鍋、離心機(jī)、可調(diào)式移液器、研 缽、蒸餾水。 四、蔗糖磷酸合成酶（SPS）的測(cè)定： 建議正式實(shí)驗(yàn)前選取 2 個(gè)樣本做預(yù)測(cè)定，了解本批樣品情況，熟悉實(shí)驗(yàn)流程，避免實(shí)驗(yàn) 樣本和試劑浪費(fèi)！ 1、樣本制備： ① 組織樣本： 稱樣本 0.1g（水分充足的樣本可取 0.5g）于研缽中，加入 1mL 提取液，冰浴勻漿。 12000rpm，4℃離心 10min，取上清液，置冰上待測(cè)。 【注意】 若樣本含糖量高，可引起 A 對(duì)照值較大如超過(guò) 1.6，即檢測(cè)背景值過(guò)高會(huì)影響檢測(cè)，可在樣本 制備過(guò)程中增加除糖步驟：取約 0.1g 組織（水分充足的樣本可取 0.5g），加入 1mL 經(jīng)預(yù)冷的 95%乙醇 冰浴勻漿，4℃放置 10min；12000rpm，4℃離心 5min；棄上清，留沉淀，向沉淀中加入經(jīng)預(yù)冷的 80% 乙醇混勻，4℃放置 5min；12000rpm，4℃離心 5min；棄上清，留沉淀。再向沉淀中加入 1mL 經(jīng)預(yù)冷 提取液渦旋混勻，4℃放置 10min；12000rpm，4℃離心 10min；留上清，棄沉淀。上清液置冰上待測(cè)。 ② 液體樣本：直接測(cè)定。 若渾濁，離心后取上清檢測(cè)。 2、上機(jī)檢測(cè)： ① 可見(jiàn)分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 480nm，蒸餾水調(diào)零。 ② 在 EP 管中依次加入： 試劑名稱（μL） 測(cè)定管 對(duì)照管 試劑一 80 蒸餾水 80 樣本 40 40 37℃水浴 20min 試劑二 20 20本試劑盒僅供科研使用 2 試劑二需直接加到反應(yīng)液里面，且務(wù)必混勻（可用槍頭吸打），95℃水 浴中煮沸 10min（可用封口膜纏緊，防止水分散失），冷卻至室溫。 試劑三 400 400 試劑四 120 120 混勻，95℃水浴 20min，冷卻后液體全部轉(zhuǎn)入 1mL 玻璃比色皿（光徑 1cm）中，480nm 下讀取吸光值 A。ΔA=A 測(cè)定-A 對(duì)照（每個(gè)測(cè)定管 需設(shè)一個(gè)對(duì)照管）。 【注】：若ΔA 值過(guò)小如在零附近徘徊，可延長(zhǎng) 37℃水浴時(shí)間 T（如 40min 或更長(zhǎng)）或增加樣本取樣 量 W（如增至 0.2g），或者增加樣本的加樣體積 V1（如 80μL，則試劑三相應(yīng)減少），相應(yīng)的 變量重新代入計(jì)算公式計(jì)算。 五、計(jì)算公式： 1、標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y = 0.0042x - 0.0016；x 是標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量（μg），y 是ΔA。 2、按照蛋白濃度計(jì)算： 單位定義：每毫克組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1μg 蔗糖定義為一個(gè)酶活力單位。 SPS 活性(μg /min/mg prot)=[(ΔA+0.0016) ÷0.0042]÷(V1×Cpr)÷T =297.6×(ΔA+0.0016)÷Cpr 3、按照樣本鮮重計(jì)算： 單位定義：每克組織每分鐘催化產(chǎn)生 1μg 蔗糖定義為一個(gè)酶活力單位。 SPS 活性(μg /min/g 鮮重)=[(ΔA+0.0016) ÷0.0042]÷(V1÷V×W)÷T =297.6×(ΔA+0.0016)÷W 4、按照液體體積計(jì)算： 單位定義：每毫升液體每分鐘催化產(chǎn)生 1μg 蔗糖定義為一個(gè)酶活力單位。 SPS 活性(μg /min/mL)=[(ΔA+0.0016) ÷0.0042]÷V1÷T =297.6×(ΔA+0.0016) V---加入提取液體積，1mL； V1---加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.04mL； W---樣本鮮重，g； T ---反應(yīng)時(shí)間：20min； Cpr---樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；建議使用本公司的 BCA 蛋白含量檢測(cè)試劑盒。 附：標(biāo)準(zhǔn)曲線制作過(guò)程： 1 制備標(biāo)準(zhǔn)品母液（10mg/mL）：向標(biāo)準(zhǔn)品 EP 管里面加入 1mL 蒸餾水（母液需在兩天 內(nèi)用且-20℃保存）。 2 把母液稀釋成六個(gè)濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品：0, 1.6, 3.2, 4.8, 6.4, 8. mg/mL。也可根據(jù)實(shí)際 樣本來(lái)調(diào)整標(biāo)準(zhǔn)品濃度。 3 按照：40μL 標(biāo)準(zhǔn)品+80μL 蒸餾水+20μL 試劑二+400μL 試劑三+120μL 試劑四，依次 加樣操作，95℃水浴 20min，冷卻后液體轉(zhuǎn)入 1mL 玻璃比色皿（光徑 1cm）中，480nm 下測(cè)定，根據(jù)結(jié)果即可制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。