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外切-β-1,4-葡聚糖酶(CBH)試劑盒

外切-β-1,4-葡聚糖酶(CBH)試劑盒

本試劑盒僅供科研使用 1 外切-β-1,4-葡聚糖酶/纖維二糖水解酶（CBH）試劑盒說明書 （貨號：WS4350F 分光法 48 樣） 一、產(chǎn)品簡介： 外切-β-1,4-葡聚糖酶又稱纖維二糖水解酶（CBH）（EC 3.2.1.91）存在于細(xì)菌、真菌和 動物體內(nèi)，是纖維素酶系的組份之一，該酶作用于β-1,4-糖苷鍵，每次切下一個纖維二糖（還 原糖）分子，在堿性條件下，產(chǎn)生的還原糖能與3,5-二硝基水楊酸反應(yīng)生成棕紅色物質(zhì)， 該物質(zhì)在540nm下有吸收峰，即可得出外切-β-1,4-葡聚糖酶的酶活性大小。 二、試劑盒組分與配制： 試劑名稱 規(guī)格 保存要求 備注 提取液 液體 60mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 液體 33mL×1 瓶 4℃保存 試劑二 粉劑×1 瓶 4℃保存 臨用前加 16.5mL 試劑一，充分混 勻呈分散狀態(tài)，每次用前務(wù)必混勻。 試劑三 液體 33mL×1 瓶 4℃保存 標(biāo)準(zhǔn)品 粉體 mg×1 支 4℃保存 若重新做標(biāo)曲，則用到該試劑。 三、所需的儀器和用品： 可見分光光度計、1mL 玻璃比色皿（光徑 1cm）、水浴鍋、離心機、可調(diào)式移液器、研 缽、冰和蒸餾水。 四、外切-β-1,4-葡聚糖酶活性測定： 建議正式實驗前選取 2 個樣本做預(yù)測定，了解本批樣品情況，熟悉實驗流程，避免實驗 樣本和試劑浪費！ 1、樣本制備： ① 組織：稱取約 0.2g 組織（水分充足的樣本可取 1g），加入 1mL 經(jīng)預(yù)冷的 95%乙醇冰 浴勻漿，4℃放置 10min；12000rpm，4℃離心 5min；棄上清，留沉淀，向沉淀中加入 經(jīng)預(yù)冷的 80%乙醇混勻，4℃放置 10min；12000rpm，4℃離心 5min；棄上清，留沉淀。 再向沉淀中加入 1mL 經(jīng)預(yù)冷提取液，渦旋混勻，4℃放置 10min；12000rpm，4℃離心 10min；留上清，棄沉淀。上清液置冰上待測。 ② 細(xì)菌/培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；取約 500 萬細(xì)菌或 細(xì)胞加入 1mL 提取液，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s， 間隔 10s，重復(fù) 30 次）；12000rpm，4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。 【注】：若增加樣本量，可按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104 個）：提取液體積（mL）為 500：1 比例進行提取。 ③ 液體樣本：若是澄清液體，直接檢測，若液體樣本渾濁，需 4℃×12000rpm，離心 10min，取上清液檢測。 2、上機檢測： ① 可見分光光度計預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 540nm，蒸餾水調(diào)零。 ② 所有試劑解凍至室溫（25℃），試劑二使用前務(wù)必混勻。 ③ 在 EP 管中依次加入： 試劑名稱（μL） 測定管 對照管 樣本 100 100 試劑一 300 試劑二 300 37℃孵育 60min 試劑三 300 300本試劑盒僅供科研使用 2 混勻，95℃水浴 5min，取出后用自來水或冰水冷卻至室溫， 取全部澄清液體于 1mL 玻璃比色皿（光徑 1cm）中，在 540nm 處讀取吸光值 A，ΔA=A 測定管-A 對照管（每個樣 本做一個對照管）。 【注】若ΔA 在零附近，可增加樣本取樣質(zhì)量 W 或增加樣本加樣體積 V1（如增至 150μL， 則試劑三相應(yīng)減少），則改變后的 W 和 V1 需代入計算公式重新計算。 五、結(jié)果計算： 1、標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為 y = 0.0099x - 0.0747；x 為標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量（μg），y 為ΔA。 2、按照蛋白濃度計算 單位定義：每毫克組織蛋白每小時催化產(chǎn)生 1μg 還原糖定義為一個酶活力單位。 外切-β-1,4-葡聚糖酶活力(μg/h/mg prot)=[( ΔA+0.0747)÷0.0099]÷(Cpr×V1) ÷T =1010.1×( ΔA+0.0747)÷Cpr 3、按樣本鮮重計算 單位定義：每克組織每小時催化產(chǎn)生 1μg 還原糖定義為一個酶活力單位。 外切-β-1,4-葡聚糖酶活力(μg/h/g 鮮重)=[(ΔA+0.0747)÷0.0099]÷(W×V1÷V) ÷T =1010.1×( ΔA+0.0747)÷W 4、按細(xì)菌/細(xì)胞密度計算 單位定義：每 1 萬個細(xì)菌或細(xì)胞每小時催化產(chǎn)生 1μg 還原糖定義為一個酶活力單位。 外切-β-1,4-葡聚糖酶活力(μg /h/104 cell)=[(ΔA+0.0747)÷0.0099]÷(500×V1÷V) ÷T =2×(ΔA+0.0747) 5、按液體體積計算 單位定義：每毫升液體每小時催化產(chǎn)生 1μg 還原糖定義為一個酶活力單位。 外切-β-1,4-葡聚糖酶活力(μg /h/mL)=[( ΔA+0.0747)÷0.0099]÷V1 ÷T =1010.1×( ΔA+0.0747) V---加入提取液體積，1 mL； V1---加入樣本體積，0.1mL； T---反應(yīng)時間，60min=1 小時； W---樣本質(zhì)量，g； 500---細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬； Cpr---樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；建議使用本公司的 BCA 蛋白含量檢測試劑盒； 附：標(biāo)準(zhǔn)曲線制作過程： 1 制備標(biāo)準(zhǔn)品母液（2mg/mL）：從標(biāo)準(zhǔn)品管中稱量取出 4mg 至一新 EP 管中，再加 2mL 蒸餾水混勻溶解即 2mg/mL 的葡萄糖（母液需在兩天內(nèi)用且-20℃保存）。 2 把母液用蒸餾水稀釋成六個濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品：0, 0.4, 0.8, 1.2, 1.6, 2. mg/mL。也可 根據(jù)實際樣本來調(diào)整標(biāo)準(zhǔn)品濃度。 3 依據(jù)對照管的加樣表操作，根據(jù)結(jié)果即可制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。