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幾丁質(zhì)外切酶試劑盒

幾丁質(zhì)外切酶試劑盒說明書 

（貨號(hào)：WS7450F 分光法 24 樣）

一、產(chǎn)品簡介： 多種微生物、動(dòng)物、植物等都可產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶，高等植物本身不存在作為真菌細(xì)胞壁 組分之一的幾丁質(zhì)，但當(dāng)植物受到病原菌感染時(shí)，幾丁質(zhì)酶活性迅速提高。因此該酶與 植物對(duì)病原微生物的抗性有關(guān)，是重要的病程相關(guān)蛋白。 幾丁質(zhì)酶主要水解幾丁質(zhì)多聚體中β-1,4-糖苷鍵。依據(jù)水解位置的不同可分為幾丁質(zhì) 內(nèi)切酶和幾丁質(zhì)外切酶，幾丁質(zhì)外切酶作用于幾丁質(zhì)后，生成 N-乙酰氨基葡萄糖單體， 進(jìn)一步與鐵氰化jia反應(yīng)，于 420nm 處檢測，進(jìn)而計(jì)算得到幾丁質(zhì)外切酶活性大小。 二、試劑盒組分與配制： 試劑名稱 規(guī)格 保存要求 備注 提取液 液體 30mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 液體 7mL×1 瓶 4℃保存 試劑二 粉體 mg×1 瓶 4℃保存 臨用前甩幾下使粉體落入底部， 再加 2.5mL 鹽酸充分混勻溶解 后，再加 2.8mL 蒸餾水混勻備用。 試劑三 液體 14mL×1 瓶 4℃保存 試劑四 粉體 g×1 瓶 4℃保存 臨用前甩幾下使粉體落入底部， 再加 30mL 蒸餾水溶解備用。 標(biāo)準(zhǔn)品 粉劑×1 支 4℃保存 若重新做標(biāo)曲，則用到該試劑 三、所需的儀器和用品： 可見分光光度計(jì)、1mL 玻璃比色皿（光徑 1cm）、天平、水浴鍋、低溫離心機(jī)、鹽酸。 四、幾丁質(zhì)外切酶活性測定： 建議正式實(shí)驗(yàn)前選取 2 個(gè)樣本做預(yù)測定，了解本批樣品情況，熟悉實(shí)驗(yàn)流程，避免實(shí)驗(yàn) 樣本和試劑浪費(fèi)！ 1、樣本制備： ① 組織樣本：稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液，進(jìn)行冰浴勻漿，于 4℃，12000rpm 離心 10min，取上清置冰上待測。 【注】：若增加樣本量，可按照提取液體積(mL) ：組織質(zhì)量（g）為 1：5~10 的比例進(jìn)行提取 ② 真菌樣本：先收集細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；取 500 萬細(xì)胞加入 1mL 提取液； 冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率 300w，超聲 3 秒，間隔 7 秒，總時(shí)間 3min）；于 4℃， 12000rpm 離心 10min，取上清置于冰上待測。 【注】：若增加樣本量，可按照提取液（mL）：細(xì)細(xì)胞數(shù)量（104）為 1：500~1000 的比例進(jìn)行提取 2、上機(jī)檢測： ① 可見分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 420nm，蒸餾水調(diào)零。 ② 在 EP 管中依次加入： 試劑名稱（µL） 測定管 對(duì)照管 樣本 120 煮沸的樣本 120 試劑一 80 80 試劑二 100 100 混勻，37℃（恒溫培養(yǎng)箱）孵育 1.5h 后,4000rpm 離心 5min，取上清本試劑盒僅供科研使用 2 ③ 在 EP 管中依次加入： 上清液 200 200 試劑三 270 270 混勻，4000rpm 離心 5min，取上清液待測 ④ 在 EP 管中依次加入： 上清液 360 360 試劑四 480 480 混勻，95-100℃煮沸 8min，取全部液體至 1mL 比色皿中于 420nm 處 讀取各管吸光值 A，ΔA＝A 對(duì)照-A 測定（每個(gè)樣本做一個(gè)自身對(duì)照）。 【注】1. 煮沸的樣本：于 95-100℃煮沸 10min，使樣本里面的酶失去活性。 2. 若ΔA 較小，可以加大樣本量（如增至 140µL，則試劑一相應(yīng)減少），或增加樣本取樣量 （如 0.2g），則改變后的 V1 和樣本 W 需代入公式重新計(jì)算。 五、結(jié)果計(jì)算： 1、 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y = 0.0248x + 0.0024，X 是標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量（μg），y 是ΔA。 2、按照樣本重量計(jì)算： 定義：每克組織每小時(shí)分解幾丁質(zhì)產(chǎn)生 1μgN-乙酰氨基葡萄糖的酶量為一個(gè)單位。 幾丁質(zhì)外切酶活性(μg/h/g 鮮重)=[(ΔA-0.0024)÷0.0248×1.96]÷(V1÷V×W)÷T =439.1×(ΔA-0.0024)÷W 3、按照蛋白質(zhì)濃度計(jì)算： 定義：每毫克蛋白每小時(shí)分解幾丁質(zhì)產(chǎn)生 1μgN-乙酰氨基葡萄糖的酶量為一個(gè)單位。 幾丁質(zhì)外切酶活性(μg/h/mg prot)=[(ΔA-0.0024) ÷0.0248×1.96]÷(V1×Cpr)÷T =439.1×(ΔA-0.0024)÷Cpr 4、按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算： 定義：每 104個(gè)細(xì)胞每小時(shí)分解幾丁質(zhì)產(chǎn)生 1μgN-乙酰氨基葡萄糖的酶量為一個(gè)單位。 幾丁質(zhì)外切酶活性(μg/h/104 cell)=[(ΔA-0.0024) ÷0.0248×1.96]÷(V1÷V×細(xì)胞數(shù)量) =439.1×(ΔA-0.0024)÷細(xì)胞數(shù)量 V---加入提取液體積，1mL； V1---樣本體積，0.12mL； T---反應(yīng)時(shí)間，1.5h； 1.96---體積系數(shù)； W---樣本質(zhì)量，g； 標(biāo)準(zhǔn)品分子量---221.21； Cpr---樣本蛋白濃度，mg/mL，建議使用本公司的 BCA 蛋白含量檢測試劑盒。 附：標(biāo)準(zhǔn)曲線制作過程： 1 制備標(biāo)準(zhǔn)品母液（1mg/mL）：標(biāo)準(zhǔn)品臨用前加 2mL 蒸餾水，即為 1mg/mL。 2 把母液稀釋成以下濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品：0, 0.02, 0.04, 0.06, 0.08, 0.1mg/mL。 3 依據(jù)第④步驟的加樣體系：360μL 標(biāo)準(zhǔn)品+480μL 試劑六，混勻，95-100℃煮沸 10min，取全部液 體至 1mL 比色皿中于 420nm 處讀取各管吸光值 A，標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量作為橫坐標(biāo)，0 mg/mL 對(duì)應(yīng)的 A 值減去各濃度標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)的 A 之差作為縱坐標(biāo)，即可得出標(biāo)準(zhǔn)曲線。