干擾素的制備及檢測實(shí)驗(yàn)介紹

實(shí)驗(yàn)原理

干抗素是干擾素誘生劑作用于有關(guān)生物細(xì)胞所產(chǎn)生的一類高活性、多功能蛋白質(zhì)。它從細(xì)胞產(chǎn)生和釋放出來以后，又作用于相應(yīng)的其它同種細(xì)胞，使其獲得抗病毒及抗腫瘤等多方面的免疫力。

所謂干擾素誘生劑，是指能誘導(dǎo)有關(guān)生物細(xì)胞產(chǎn)生干擾素的一類物質(zhì)。能誘導(dǎo)有關(guān)生物細(xì)胞產(chǎn)生α和β干擾素者稱甲類干擾素誘生劑，如各種動(dòng)物病毒、細(xì)胞內(nèi)寄生的微生物等；可誘導(dǎo)T細(xì)胞產(chǎn)生γ干擾素的稱為乙類干擾素誘生劑，如脂多糖、鏈球菌毒素、腸毒素A等。

在實(shí)際工作中，制備干擾素多采用兩種方法。一是用干擾素誘生劑誘導(dǎo)某些生物細(xì)胞產(chǎn)生干擾素，經(jīng)提取純化并檢定合格后即可使用。該法所用的細(xì)胞多為外周血白細(xì)胞。二是采用基因工程法進(jìn)行生產(chǎn)，即將干擾素基因?qū)氪竽c桿菌內(nèi)，通過培養(yǎng)大腸桿菌來生產(chǎn)干擾素。目前，大規(guī)模生產(chǎn)干擾素主要采用基因工程法。

實(shí)驗(yàn)設(shè)備

細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備(如培養(yǎng)瓶、多孔培養(yǎng)板、溫箱、顯微鏡、旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)器等)、水浴箱等。

實(shí)驗(yàn)步驟

1. 制備誘生劑：采用NDVF系弱毒株，以雞胚尿囊液形式保存于-20℃，

其血凝滴度穩(wěn)定在1:640～1:1 280之間。大量繁殖時(shí)，用0.5%水解乳蛋白稀釋100～1 000倍，接種于9日齡雞胚尿囊腔，置37℃培養(yǎng)72h后，收獲尿囊液，效價(jià)測定應(yīng)大于1:640，無菌檢查應(yīng)合格。

2. 制備誘生細(xì)胞：無菌采取人外周血(多用人臍帶血，或血庫貯藏血)，置于含肝素的無菌瓶內(nèi)，于4℃保存不超過24h，誘生細(xì)胞(白細(xì)胞)不單獨(dú)提取，以全血代替。

3. 制備粗制干擾素：

   1) 加誘生劑，按1ml抗凝全血加0.2ml誘生劑(即NDVF系尿囊液，其血凝滴度不低于1:640)；

   2) 加溫吸附，將加有誘生劑的抗凝全血置37℃水浴中1h，每隔15min晃動(dòng)一次，使NDVF吸附于白細(xì)胞上。然后以1000r/min離心20min，棄上清，留沉淀物；

   3) 加營養(yǎng)液孵育誘生，按抗凝全血的1～2倍量加Eagle營養(yǎng)液于上述沉淀物中，混勻，置35～36℃溫箱內(nèi)旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)18～20h；

   4) 離心及酸處理，將上述培養(yǎng)物以2000r/min離心30min，取上清，以6mol/L鹽酸將其pH值調(diào)至2.0，置4℃冰箱5天滅活NDV；

   5) 中性化，經(jīng)5天酸化后，再用6mol/L氫氧化鈉將pH值調(diào)至7.2～7.4，即為粗制干擾素。

4. 制備精品干擾素：

   1) KCNS沉淀，取上述粗制干擾素，加KCNS并用2mol/L HCl調(diào)pH值為3.5，然后以2 000r/min離心30min取沉淀；

   2) 酒精提取，將沉淀溶于95%酒精(預(yù)冷至-20℃)，用2mol/L NaOH調(diào)pH值為4.2，以2 000r/min離心30min取上清；用2mol/L HCl調(diào)pH值至3.5，離心后取上清，再將pH值調(diào)至5.6，離心后取上清，zui后將pH值調(diào)至7.1，離心后取沉淀；

   3) 過碘酸鈉沉淀，將沉淀溶于PBS中，加過碘酸鈉，并調(diào)pH值為4.5，用50%乙醇10倍稀釋，離心后取上清，將上清液對0.3mol/L (NH4)2CO3(pH值7.6)在4℃下透析過夜。

   4) sephacryl S200柱層析：將sephacryl S200按要求處理后裝柱(4～5×100cm柱)，用PBS平衡后，加樣(即上述上清液)，用洗液洗脫。洗脫期間用核酸蛋白儀連續(xù)檢測，收集相應(yīng)峰即為精制干擾素。取樣進(jìn)行效價(jià)測定，按結(jié)果進(jìn)行稀釋，分裝并凍干。

5. 檢定

   1) 效價(jià)測定

      a. 制備攻擊病毒：將水泡性口炎病毒(VSV)在雞胚成纖維母細(xì)胞上傳代后，

再在豬細(xì)胞(IBRS)上傳3～5代，使其對IBRS有良好致病效應(yīng)，其TCID50應(yīng)穩(wěn)定(一般在10-6～10-7之間)。

      b. 準(zhǔn)備測定細(xì)胞：生長良好的幼齡IBRS單層細(xì)胞。

      c. 測定：取上述單層細(xì)胞分為若干組，每組加不同稀釋度的干擾素，置37℃孵育20～24h，然后每管均用100個(gè)TCID50的VSV攻擊，置37℃ 48～72h孵育后，觀察結(jié)果。同時(shí)設(shè)細(xì)胞對照組和病毒對照組。病毒對照組CPE＞75%，正常細(xì)胞對照組CPE=0，即認(rèn)為該測定系統(tǒng)有效。干擾素判定標(biāo)準(zhǔn)是以能保護(hù)半數(shù)細(xì)胞免受攻擊病毒損害的干擾素zui高稀釋度的倒數(shù)作為干擾素的單位。

   2) 酸堿度測定

取本品10支，加水溶解，精密測量pH值應(yīng)為6.0～7.5。

   3) 水分測定

按磺硫溶液法測定，不得超過3%。

   4) 安全試驗(yàn)

取本品加水溶解，小鼠尾靜脈注射，48h內(nèi)不得有死亡。

   5) 熱原檢查

取本品1支，加水溶解，依法檢查，應(yīng)符合規(guī)定。

   6) 菌檢

取本品3支，無菌水溶解，分別接種到檢查需氧菌、厭氧菌及霉菌用培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)1周，應(yīng)無菌生長。

   7) 超敏反應(yīng)

取健康豚鼠6只，每只腹腔注射本品適量，連續(xù)3次，于20天后再于耳靜泳注入本品適量，應(yīng)無過敏反應(yīng)現(xiàn)象發(fā)生。

注意事項(xiàng)

1. 制備NDVF系弱毒誘生劑時(shí)，種毒應(yīng)無菌檢查合格，且滴度在1:640以上。收毒時(shí)，應(yīng)將污染的雞胚棄去。

2. 不必從血液中將白細(xì)胞提取出來，因紅細(xì)胞對白細(xì)胞產(chǎn)生干擾素有營養(yǎng)作用。純化的白細(xì)胞產(chǎn)生干擾素效價(jià)不一定高。

3. 酸化的目的是殺死其中的誘生劑NDV，而在pH值20時(shí)，干擾素是穩(wěn)定的。

4. 在常溫下干擾素半衰期很短。故各種操作要在低溫環(huán)境下進(jìn)行，動(dòng)作要迅速，純化所用試劑要作預(yù)冷處理。干擾素粗品及精品要及時(shí)置低溫下存放。效價(jià)測定時(shí)，干擾素應(yīng)于臨用時(shí)現(xiàn)溶解。