感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化操作流程及提高轉(zhuǎn)化效率的建議有哪些

1、在冰上預(yù)冷2支14-ml BD Falcon聚丙烯圓底離心管.1支用來轉(zhuǎn)化樣品,1支做pUC18對(duì)照.同時(shí)將NZY+ broth培養(yǎng)基在42°C預(yù)熱.
2、冰上融化感受態(tài)細(xì)胞.融化時(shí)輕輕將細(xì)胞混勻并分裝成100ul/管.
3、每管中加入隨試劑盒提供的4 ml b-ME(巰基乙醇).
4、溫和轉(zhuǎn)動(dòng)試管,將細(xì)胞在冰上放置10分鐘,每2分鐘溫和轉(zhuǎn)動(dòng)一下.
5、每管細(xì)胞加入0.1–50 ng樣品DNA (或2 ml連接反應(yīng)物)(參見DNA 質(zhì)量與體積說明.)用滅菌dH2O水按1:10稀釋對(duì)照pUC18 DNA,并取1 ml稀釋的pUC18 DNA加入轉(zhuǎn)化細(xì)胞.
6、溫和轉(zhuǎn)動(dòng)試管,并在冰上放置30分鐘.
7、試管在42°C水浴熱激30秒.熱激時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化效率極度重要.
8、試管冰浴2 分鐘.
9、每管加入0.9 ml 預(yù)熱 (42°C) 的NZY+ 肉湯,37°C、225–250 rpm 搖床培養(yǎng)1 小時(shí).
10、取 200 ml轉(zhuǎn)化混和物鋪帶有相應(yīng)篩選抗生素的LB瓊脂糖平板(如果進(jìn)行顏色篩選還需加入IPTG和X-gal).pUC18陽性對(duì)照則取5 ml 鋪氨芐*LB瓊脂糖平板.
    注意:細(xì)胞經(jīng) 1000 rpm離心 10分鐘會(huì)聚集,應(yīng)將細(xì)胞沉淀用 200 *l NZY+ 肉湯重懸.如果用于鋪板的細(xì)胞 <100 ml,先將細(xì)胞加入200 ml培養(yǎng)基中,然后用滅菌涂布棒鋪板.如果采用100 ml細(xì)胞則可以直接鋪板.傾斜涂布棒并輕輕拍打,盡量減少涂布棒上的細(xì)胞殘留.
11、37°C培養(yǎng)過夜.顏色篩選請(qǐng)參見以下Blue-White Color Screening的操作指南.
12、pUC18陽性對(duì)照預(yù)計(jì)有約250個(gè)克隆(?5 × 109 cfu/mg pUC18 DNA).而樣品DNA的轉(zhuǎn)化效率隨DNA的量和組成(超螺旋或連接產(chǎn)物)有較大差異,大質(zhì)粒和非超螺旋DNA往往得到較少的克隆