為了提高轉(zhuǎn)化效率, 實(shí)驗(yàn)中要考慮以下幾個(gè)重要因素：

1. 細(xì)胞生長狀態(tài)和密度: 不要用經(jīng)過多次轉(zhuǎn)接或儲(chǔ)于4℃的培養(yǎng)菌，從-70℃或-20℃甘油保存的菌種中直接轉(zhuǎn)接用于制備感受態(tài)細(xì)胞的菌液。細(xì)胞生長密度以剛進(jìn)入對(duì)數(shù)生時(shí)為好，可通過監(jiān)測培養(yǎng)液的OD600 來控制。DH5α菌株的OD600 為0.5時(shí),細(xì)胞密度在5×107 個(gè)/ml左右(不同的菌株情況有所不同),這時(shí)比較合適。密度過高或不足均會(huì)影響轉(zhuǎn)化效率。

2. 質(zhì)粒的質(zhì)量和濃度: 用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒dna應(yīng)主要是超螺旋態(tài)DNA(cccDNA)。轉(zhuǎn)化效率與外源DNA的濃度在一定范圍內(nèi)成正比,但當(dāng)加入的外源DNA的量過多或體積過大時(shí),轉(zhuǎn)化效率就會(huì)降低。1ng的cccDNA即可使50μl 的感受態(tài)細(xì)胞達(dá)到飽和。一般情況下,DNA溶液的體積不應(yīng)超過感受態(tài)細(xì)胞體積的5%。

3. 試劑的質(zhì)量: 所用的試劑,如CaCl2 等均需是zui高純度的(GR.或AR.),并用超純水配制,分裝保存于干燥的冷暗處。

4. 防止雜菌和雜DNA的污染：整個(gè)操作過程均應(yīng)在無菌條件下進(jìn)行, 所用器皿, 如離心管, tip頭等是新的,并經(jīng)高壓滅菌處理,所有的試劑都要滅菌,且注意防止被其它試劑、DNA酶或雜DNA所污染, 否則均會(huì)影響轉(zhuǎn)化效率或雜DNA的轉(zhuǎn)入, 為以后的篩選、鑒定帶來不必要的麻煩。 本實(shí)驗(yàn)以E.coli DH菌株為受體細(xì)胞,并用CaCl2處理,使其處于感受態(tài),然后與pBS質(zhì)粒共保溫,實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化。由于pBS質(zhì)粒帶有氨芐抗性基因(Ampr )，可通過Amp抗性來篩選轉(zhuǎn)化子。如受體細(xì)胞沒有轉(zhuǎn)入pBS，則在含Amp的培養(yǎng)基上不能生長。能在Amp培養(yǎng)基上生長的受體細(xì)胞(轉(zhuǎn)化子)肯定已導(dǎo)入了pBS。轉(zhuǎn)化子擴(kuò)增后，可將轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒提取出，進(jìn)行電泳、酶切等進(jìn)一步鑒定。 本實(shí)驗(yàn)以E.coli DH菌株為受體細(xì)胞,并用CaCl2處理,使其處于感受態(tài),然后與pBS質(zhì)粒共保溫,實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化。由于pBS質(zhì)粒帶有氨芐抗性基因(Ampr )，可通過Amp抗性來篩選轉(zhuǎn)化子。如受體細(xì)胞沒有轉(zhuǎn)入pBS，則在含Amp的培養(yǎng)基上不能生長。能在Amp培養(yǎng)基上生長的受體細(xì)胞(轉(zhuǎn)化子)肯定已導(dǎo)入了pBS。轉(zhuǎn)化子擴(kuò)增后，可將轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒提取出，進(jìn)行電泳、酶切等進(jìn)一步鑒定。