酶切實驗
本實驗學習用限制性核酸內切酶(Restriction endonuclease)EcoRI 切割λDNA及質粒pBR322DNA，瓊脂糖凝膠電泳后觀察酶切結果。
【原理】
λDNA 是大腸桿菌的一種溫和噬菌體DNA，雙股線狀，分子大小為48.5 kb。 EcoRI酶可識別DNA中 G↓AATTC核苷酸序列，并在箭頭處將其切開。λDNA含有5個EcoRI酶識別位點，可將λDNA切成6個大小不同的片斷。pBR322 DNA為人工構建的質粒dna, 分子大小為4.3 kb，含有1個EcoR I酶切點，切割后由環(huán)狀DNA變?yōu)榫€形DNA。
【材料】
1.λDNA(0.1ug/ul)，pBR322 DNA(0.25 ug/ul)
2.限制性內切酶EcoRI
3.EcoRI 酶切緩沖液(Buffer solution 10×)
4.去離子水
5.電泳及染色用材料
【方法】
1.取潔凈EP管2只，按表10-1加入各成分。
2.混勻，放370C水浴1-2h。65℃水浴10min，再放4℃冰箱8min終止反應。部分酶切DNA片段用于DNA連接實驗，另一部分放4℃冰箱，待瓊脂糖凝膠電泳檢測。
(二)DNA連接實驗
T4 DNA 連接酶是一單鏈多肽，分子量為68,000道爾頓，它能催化雙鏈DNA上相鄰的3ˊ羥基和5ˊ磷酸末斷形成磷酸二脂鍵。λDNA用EcoRI酶切割后形成的6個片斷均具有粘性末端(Cohesive ends)，在T4 DNA 連接酶作用下，可連接成原來的線狀DNA
【材料】
1.λDNAEcoRI酶切片段
2.T4 DNA連接酶
3.T4 DNA連接酶緩沖液(10×)
4.去離子水
【方法】
1.取潔凈EP管1只，分別加入：
①去離子水 7ul,
②T4 DNA連接酶緩沖液(10×) 2 ul，
③λDNA酶切片段(已65℃10分鐘滅活)10ul
④T4 DNA連接酶1ul
2.混勻后，放13℃水浴過夜，待電泳檢測。
