質(zhì)粒dna的提取是DNA技術(shù)中的*實(shí)驗(yàn)技能。質(zhì)粒DNA上攜帶的基因信息可經(jīng)過(guò)基因表達(dá)實(shí)驗(yàn)后表現(xiàn)出相應(yīng)的性狀。質(zhì)粒DNA的分離提取包括了培養(yǎng)細(xì)胞——收集——分離純化三大步驟。

質(zhì)粒是細(xì)胞內(nèi)的一種環(huán)狀的小分子DNA，是進(jìn)行DNA重組的常用載體。作為一個(gè)具有自身復(fù)制起點(diǎn)的復(fù)制單位獨(dú)立于細(xì)胞的主染色體之外，質(zhì)粒dna上攜帶了部分的基因信息，經(jīng)過(guò)基因表達(dá)后使其宿主細(xì)胞表現(xiàn)相應(yīng)的性狀。在DNA重組中，質(zhì)?；蚪?jīng)過(guò)改造后的質(zhì)粒載體可通過(guò)連接外源基因構(gòu)成重組體。

從宿主細(xì)胞中提取質(zhì)粒DNA，是DNA重組技術(shù)中zui基礎(chǔ)的實(shí)驗(yàn)技能。分離質(zhì)粒DNA有三個(gè)步驟：

1、培養(yǎng)細(xì)菌使質(zhì)粒擴(kuò)增

2、收集和裂解細(xì)菌

3、分離和純化質(zhì)粒DNA

堿裂解法是較常用的提取的方法。其優(yōu)點(diǎn)是得率高，適合于大多數(shù)的和菌株，所得產(chǎn)物經(jīng)純化后可滿足多數(shù)的DNA重組操作。此法采取酸堿度高達(dá)Ph12.6的堿溶液使DNA發(fā)生變性。由于質(zhì)粒和主染色體的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)不同，變性時(shí)前者雖然兩條鏈分離，但仍然纏繞在一起不分開(kāi);而后者*變性分，甚至出現(xiàn)斷裂。因此，當(dāng)加入中和液時(shí)，溶液Ph值恢復(fù)較低的近中性水平，此時(shí)， 質(zhì)粒的兩條小分子單鏈可迅速?gòu)?fù)性，恢復(fù)雙鏈結(jié)構(gòu)，但是主染色體DNA則無(wú)法復(fù)性。在離心時(shí)，大部分主染色體與細(xì)胞碎片，雜質(zhì)等纏繞一起被沉淀，而可溶性的質(zhì)粒DNA留在上清夜中。

在質(zhì)粒提取過(guò)程中，由于機(jī)械力、酸堿度、試劑等的原因，可能使質(zhì)粒DNA鏈發(fā)生斷裂。所以，多數(shù)質(zhì)粒粗提取物中含有三種構(gòu)型的質(zhì)粒：

共價(jià)閉合環(huán)狀DNA（cccDNA）： 質(zhì)粒的兩條鏈沒(méi)有斷裂;超螺旋

開(kāi)環(huán)DNA（ocDNA）： 質(zhì)粒的一條鏈斷裂;松弛的環(huán)狀分子

線形DNA（lDNA）： 質(zhì)粒的兩條鏈均斷裂;線性分子

三、材料、試劑及器具

1、材料

E.coliDH 5α（pUC 19 vector）

2、試劑

1）LB培養(yǎng)基

2）TE緩沖液

3）裂解液：溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ

4）酚：氯仿：異戊醇（25：24：1）

5）無(wú)水乙醇

6）70%乙醇

7）氨芐50mg/mL

器具

離心機(jī)、離心管、吸嘴

四、操作步驟

以1%比例把E.coliDH5α（含PUC18）接種于含氨芐（Amp）100μg/ml）的LB培養(yǎng)基中37℃振搖過(guò)夜（12-18h）

↓

取1.5ml培養(yǎng)物置離心管中

↓

10000rpm,離心1min，或4000rpm，離心5-10min

↓

去上清，倒扣干凈吸收紙上吸干

↓

沉淀+100μL溶液Ⅰ

↓

加或不加入少量粉末;混勻，室溫放置10min

↓

+加200μL溶液Ⅱ（新鮮配置）

↓

溫和顛倒數(shù)次，混勻，冰上放置5min

↓

+150μl溶液Ⅲ→顛倒混勻，冰上放置15min

↓

離心12000rpm,15min

↓

上清液+等體積酚：氯仿：異戊醇振勻，12000rpm,離心5min

↓

小心轉(zhuǎn)移上層至一新的離心管棄下層有機(jī)相和中層蛋白質(zhì)

↓

上清液+2倍體積無(wú)水乙醇混勻，室溫5min-10min

↓

12000rpm,5min-15min

↓棄上清

沉淀+1mL70%乙醇

↓

12000rpm離心5min-15min

↓

棄上清;并倒扣離心管使液體流干

↓+

自然干燥或真空抽干（看不到液滴為宜）

↓

加50μlTE緩沖液（20μg/mlRNaseA）溶解質(zhì)粒粗取物

↓

-20℃保存

六、實(shí)驗(yàn)報(bào)告

檢查、保存提取的質(zhì)粒，要求記錄實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象并說(shuō)明原因。

七、思考題

分析以下試劑的作用原理：

溶液Ⅰ：50mmol/L葡萄糖

5mmol/Ltris HCL （Ph 8.0）

10mmol/L EDTA（PH8.0）

溶液Ⅱ:0.4mol/L NaOH

2% SDS

使用前新鮮配制

溶液Ⅲ：5mol/L Kac 60 mL

冰醋酸11.5 mL

水28.5 mL

RNase A酶：將粉末溶于10mmol/L tris HCL （Ph7.5）、15mmol/L NACL中，配成10 mg/mL

濃度的酶液，于100℃水浴加熱15 min，緩慢冷卻至室溫，-20℃保存

氯仿

無(wú)水乙醇

附注：

1.溶液Ⅰ---溶菌液

：它是糖苷水解酶，能水解菌體細(xì)胞壁的主要化學(xué)成分肽聚糖中的β-1，4糖苷鍵，因而具有溶菌的作用。當(dāng)溶液中PH小于8時(shí)，作用受到抑制。

葡萄糖：增加溶液的粘度，維持滲透壓，防止DNA受機(jī)械切力作用降解。

EDTA的作用：

（1）螯合Mg2+ 、Ca2+ 等金屬離子，抑制脫氧核酸酶對(duì)DNA的降解作用（DNase作用時(shí)一定的金屬離子作輔基）。

（2）EDTA的存在，有利于的作用，因?yàn)榈姆磻?yīng)要求有較低的離子強(qiáng)度的環(huán)境。

2.溶液Ⅱ--NaOH-SDS液：

NaOH：核酸在pH大于5，小于9的溶液中，是穩(wěn)定的。但當(dāng)pH>12或pH<3時(shí)，就會(huì)引起雙鏈之間氫鍵的解離而變性。在溶液Ⅱ中的NaOH濃度為0.2mol/L，加抽提液時(shí)，該系統(tǒng)的PH就高達(dá)12.6，因而促使染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性。

SDS：SDS是離子型表面活性劑。它主要功能有：（1）溶解細(xì)胞膜上的脂質(zhì)與蛋白，因而溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜。（2）解聚細(xì)胞中的核蛋白。（3）SDS能與蛋白質(zhì)結(jié)合成為R-O-SO3…R┿-蛋白質(zhì)的復(fù)合物，使蛋白質(zhì)變性而沉淀下來(lái)。但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取過(guò)程中，必須把它去除干凈，防止在下一步操作中（用RNase去除RNA時(shí)）受到干擾。

3.溶液Ⅲ--3MOL/L NaAc（pH4.8）溶液

NaAc的水溶液呈堿性，為了調(diào)節(jié)pH至4.8，必須加入大量的冰醋酸。所以該溶液實(shí)際上是NaAc-Hac的緩沖液。用PH4.8的NaAc溶液是為了反pH12.6的抽提液，調(diào)回PH至中性，使變性的質(zhì)粒DNA能夠復(fù)性，并能穩(wěn)定存在。而高鹽的3MOL/L NaAc有利于變性的大分子染色體DNA，RNA，以及SDS-蛋白復(fù)合物凝聚而沉淀之。前者是因?yàn)橹泻秃怂嵘系碾姾?，減少相斥力而互相聚合，后者是因?yàn)殁c鹽與SDS-蛋白復(fù)合物作用后，能形成較小的鈉鹽形式復(fù)合物，使沉淀更*。

4.為什么用無(wú)水乙醇沉淀DNA?

用無(wú)水乙醇沉淀DNA，這是實(shí)驗(yàn)中zui常用的沉淀DNA的方法。乙醇的優(yōu)點(diǎn)是可以任意比和水相混溶，乙醇與核酸不會(huì)起任何化學(xué)反應(yīng)，對(duì)DNA很安全，因此是理想的沉淀劑。

DNA溶液是DNA以水合狀態(tài)穩(wěn)定存在，當(dāng)加入乙醇時(shí)，乙醇會(huì)奪DNA周圍的水分子，使DNA失水而易于聚合。一般實(shí)驗(yàn)中，是加2倍體積的無(wú)水乙醇與DNA相混合，其乙醇的zui終含量占67%左右。因而也可改用95%乙醇來(lái)替代懈水乙醇（因?yàn)闊o(wú)水乙醇的價(jià)格遠(yuǎn)遠(yuǎn)比95%乙醇昂貴）。但是加95%的乙醇使總體積增大，而DNA在溶液中有一定程度的溶解，因而DNA損失也增大，尤其用多次乙醇沉淀時(shí)，就會(huì)影響收得率。折中的做法初次沉淀DNA時(shí)可用95%乙醇代替無(wú)水乙醇，zui后的沉淀步驟要使用無(wú)水乙醇。也可以用0.6倍體積的異丙醇選擇性沉淀DNA。一般在室溫下放置15-30分鐘即可。

5.在用無(wú)水乙醇沉淀DNA時(shí)，為什么一定要加NaAC或NaCL至zui終濃度達(dá)0.1-0.25MOL/L?

在Ph為8左右的DNA溶液中，DNA分子是帶負(fù)電荷的，加一定濃度的NaAC或NaCL，使Na+中和DNA分子上的負(fù)電荷，減少DNA分子之間的同性電荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA鈉鹽沉淀，當(dāng)加入的鹽溶液濃度太低時(shí)，只有部分DNA形成DNA鈉鹽而聚合，這樣就造成DNA沉淀不*，當(dāng)加入的鹽溶液濃度太高時(shí)，其效果也不好。在沉淀的DNA中，由于過(guò)多的鹽雜質(zhì)存在，影響DNA的酶切等反應(yīng)，必須要進(jìn)行洗滌或重沉淀。

6.加核糖核酸酶降解核糖核酸后，為什么再要用SDS與Kac來(lái)處理?

加進(jìn)去的Rnaese本身是一種蛋白質(zhì)，為了純化DNA，又必須去除之，加SDS可使它們成為SDS-蛋白復(fù)合物沉淀，再加Kac使這些復(fù)合物轉(zhuǎn)變?yōu)槿芙舛雀〉拟淃}形式的SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物，使沉淀更加*。也可用飽和酚，氯仿抽提再沉淀，去除Rnese。在溶液中，有人以Kac代替NaAc，也可以收到較好的效果。

7.為什么在保存或抽提DNA過(guò)程中，一般采用TE緩沖液?

在基因操作實(shí)驗(yàn)中，選擇緩沖液的主要原則是考慮DNA的穩(wěn)定性及緩沖液成分不產(chǎn)生干擾作用。磷酸鹽緩沖系統(tǒng)（pKa=7.2）和硼酸系統(tǒng)（pKa=9.24）等雖然也都符合細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的生理范圍，可作DNA的保存液，但在轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)時(shí)，磷酸根離子的種類及數(shù)量將與Ca2 產(chǎn)生Ca3（PO4）2沉淀;在DNA反應(yīng)時(shí)，不同的酶對(duì)輔助因子的種類及數(shù)量要求不同，有的要求高離子濃度，有的則要求低鹽濃度，采用Tris-HCL（pKa=8.0）的緩沖系統(tǒng)，由于緩沖液是TrisH /Tris，不存在金屬離子的干擾作用，故在提取或保存DNA時(shí)，大都采用Tris-HCL系統(tǒng)，而TE緩沖液中的EDTA更能穩(wěn)定DNA的活性。

8.如何選擇聚乙二醇（6000）的濃度來(lái)沉淀DNA?

采用PEG（6000）沉淀DNA，大小不同的DNA分子所用的PEG的濃度也不同，PEG的濃度低，選擇性沉淀DNA分子量大，大分子所需PEG的濃度只需1%左右，小分子所需PEG濃度高達(dá)20%。本實(shí)驗(yàn)選擇性沉淀4.3Kb的pBR322質(zhì)粒DNA，每毫升加入0.4毫升的30%PEG，其zui終PEG濃度為12%。PEG選擇性沉淀DNA的分辯率大約100bp。

9.抽提DNA去除蛋白質(zhì)時(shí)，怎樣使用酚與氯仿較好?

酚與氯仿是非極性分子，水是極性分子，當(dāng)?shù)鞍姿芤号c酚或氯仿混合時(shí)，蛋白質(zhì)分子之間的水分子就被酚或氯仿擠去使蛋白失去水合狀態(tài)而變性。經(jīng)過(guò)離心，變性蛋白質(zhì)的密度比水的密度為大，因而與水相分離，沉淀在水相下面，從而與溶解在水相中的DNA分開(kāi)。而酚與氯仿有機(jī)溶劑比重更大，保留在zui下層。

作為表面變性的酚與氯仿，在去除蛋白質(zhì)的作用中，各有利弊，酚的變性作用大，但酚與水想有一定程度的互溶，大約10%~15%的水溶解在酚相中，因而損失了這部分水相中的DNA，而氯仿的變性作用不如酚效果好，但氯仿與水不相混溶，不會(huì)帶走DNA。所以在抽提過(guò)程中，混合使用酚與氯仿效果。經(jīng)酚*次抽提后的水相中有殘留的酚，由于酚與氯仿是互溶的，可用氯仿第二次變性蛋白質(zhì)，此時(shí)一起將酚帶走。也可以在第二次抽提時(shí)，將酚與氯仿混合（1：1）使用。

10.為什么用酚與氯仿抽提DNA時(shí)，還要加少量的異戌醇?

在抽提DNA時(shí)，為了混合均勻，必須劇烈振蕩容光煥發(fā)器數(shù)次，這時(shí)在混合液內(nèi)易產(chǎn)生氣泡，氣泡會(huì)阻止相互間的充分作用。加入異戌醇能降低分子表面張力，所以能減少抽提過(guò)程中的泡沫產(chǎn)生。一般采用氯仿與異戌醇為24：1之比。也可以采用酚，氯仿與異戌醇之比為25：24：1（不必先配制，可在臨用前把一份酚加入一份24：1的氯仿互異戌醇即成，）節(jié)同時(shí)異戌醇有助于分相，使離必后的上層水相，中層變性蛋白相以及下層有機(jī)溶劑相維持穩(wěn)定。

11.為什么要用pH8的Tris水溶液飽和酚?呈粉紅色的酚可否使用?如何保存酚不被空氣氧化?

因?yàn)榉优c水有一定的互溶。用水飽和的目的是使其抽提DNA過(guò)程中，不致吸收樣品中含有DNA的水分，減少DNA的損失。用Tris調(diào)節(jié)至PH為8是因?yàn)镈NA在此條件下比較穩(wěn)定。在中性或堿性條件下（PH5~7），RNA比DNA更容易游離到水相，所以可獲得RNA含量較少的DNA樣品。

保存在冰箱中的酚，容易被空氣氧公而變成粉紅色的，這樣的酚容易降解DNA，一般不可以使用。為了防止酚的氧化，可加入巰基乙醇和8-羥基喹啉至終濃度為0.1%。8-羥基喹啉是帶有淡黃色的固體粉末，不僅能抗氧化，并在一定程度上能抑制Dnase的活性，它是金屬離子的弱螯合劑。用Tris PH8.0水溶液飽和后的酚，分裝在棕色小試劑瓶里，上面蓋一層Tris水溶液或TE緩沖液，隔絕空氣，以裝滿蓋緊蓋子這宜，如有可能，可充氮?dú)?，防止與空氣接觸而被氧化。平時(shí)保存在4℃或-20℃冰箱中，使用時(shí)，打開(kāi)蓋子吸取后迅速加蓋，這樣可使酚不變質(zhì)，可用數(shù)月。

堿裂解法是zui常用的質(zhì)粒DNA提取方法。此實(shí)驗(yàn)過(guò)程中所涉及到的試劑都大有學(xué)問(wèn)：例如TE緩沖液有利質(zhì)粒DNA性狀穩(wěn)定，無(wú)水乙醇不與核酸發(fā)生反應(yīng)，是保存DNA*試劑等等。想了解更多請(qǐng)看上面的11個(gè)問(wèn)題。