微生物限度檢查法系檢查非規(guī)定滅菌制劑及其原料、輔料受微生物污染程度的方法。檢查項(xiàng)目包括細(xì)菌數(shù)、霉菌數(shù)、酵母菌數(shù)及控制菌檢查。

微生物限度檢查應(yīng)在環(huán)境潔凈度10000 級下的局部潔凈度100 級的單向流空氣區(qū)域內(nèi)進(jìn)行。檢驗(yàn)全過程必須嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影響供試品中微生物的檢出。單向流空氣區(qū)域、工作臺面及環(huán)境應(yīng)定期按《醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測試方法》 的現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行潔凈度驗(yàn)證。

供試品檢查時(shí)．如果使用了表面活性劑、中和劑或滅活劑，應(yīng)證明其有效性及對微生物無毒性。

除另有規(guī)定外，本檢查法中細(xì)菌及控制菌培養(yǎng)溫度為30～35 ℃ ；霉菌、酵母菌培養(yǎng)溫度為23～28 ℃ 。

檢驗(yàn)結(jié)果以1g 、lml 、10g 、l0ml 或10cm² 為單位報(bào)告，特殊品種可以zui小包裝單位報(bào)告。

檢驗(yàn)量

檢驗(yàn)量即一次試驗(yàn)所用的供試品量（g 、ml 或cm²）。

除另有規(guī)定外，一般供試品的檢驗(yàn)量為10g 或10ml；膜劑為100 cm²；貴重藥品、微量包裝藥品的檢驗(yàn)量可以酌減。要求檢查沙門菌的供試品，其檢驗(yàn)量應(yīng)增加20g 或20ml （其中10g或10ml 用于陽性對照試驗(yàn)）。

檢驗(yàn)時(shí),應(yīng)從2 個(gè)以上zui小包裝單位中抽取供試品，膜劑還不得少于4 片。

一般應(yīng)隨機(jī)抽取不少于檢驗(yàn)用星（兩個(gè)以上zui小包裝單位）的3 倍zui供試品。

供試液的制備

根據(jù)供試品的理化特性與生物學(xué)特性，采取適宜的方法制備供試液。供試液制備若需加溫時(shí)，應(yīng)均勻加熱，且溫度不應(yīng)超過45℃ 。供試液從制備至加入檢驗(yàn)用培養(yǎng)基，不得超過1 小時(shí)。

除另有規(guī)定外，常用的供試液制備方法如下。

1.液體供試品

取供試品10ml ，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml ，混勻，作為l:10 的供試液。油劑可加入適量的無菌聚山梨酯80 使供試品分散均勻。水溶性液體制劑也可用混合的供試品原液作為供試液。

2.固體、半固體或黏稠性供試品

取供試品10g ，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至1OOml ，用勻漿儀或其他適宜的方法，混勻，作為1:10 的供試液。必要時(shí)加適量的無菌聚山梨酯80 ，并置水浴中適當(dāng)加溫使供試品分散均勻。

3.需用特殊方法制備供試液的供試品

（1）非水溶性供試品

方法1   取供試品5g（或5ml ) ，加至含溶化的（溫度不超過45℃ ）5g司盤80 、3g單硬脂酸甘油酯、10g聚山梨酯80 無菌混合物的燒杯中，用無菌玻棒攪拌成團(tuán)后，慢慢加人45 ℃ 的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml ，邊加邊攪拌，使供試品充分乳化，作為1 : 20 的供試液。

方法2 取供試品10g ，加至含20ml 無菌十四烷酸異丙酯（制法見附錄XII A 無菌檢查法中供試品的無菌檢查項(xiàng)下）和無菌玻璃珠的適宜容器中．必要時(shí)可增加十四烷酸異丙酯的用量，充分振搖，使供試品溶解。然后加入45 ℃ 的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液10Oml ，振搖5～10 分鐘，萃取，靜置使油水明顯分層，取其水層作為l : 10 的供試液。

（2）膜劑供試品

取供試品100cm²，剪碎，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液100ml （必要時(shí)可增加稀釋液），浸泡，振搖，作為1:10 的供試液。

（3）腸溶及結(jié)腸溶制劑供試品

取供試品10g ，加pH6.8無菌磷酸鹽緩沖液（用于腸溶制劑）或pH7.6 無菌磷酸鹽緩沖液（用于結(jié)腸溶制劑）至100ml ，置45 ℃ 水浴中，振搖，使溶解，作為1 :10 的供試液。

（4）氣霧劑、噴霧劑供試品

取規(guī)定量供試品，置冰凍室冷凍約1 小時(shí)，取出，迅速消毒供試品開啟部位，用無菌鋼錐在該部位鉆一小孔，放至室溫，并輕輕轉(zhuǎn)動容器，使拋射劑緩緩全部釋出。用*吸出全部藥液，加至適量的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液（若含非水溶性成分，加適覺的無菌聚山梨酯80 ）中，混勻，取相當(dāng)于10g或10ml 的供試品，再稀釋成1:10 的供試液。

（5）貼劑供試品

取規(guī)定量供試品，去掉貼劑的保護(hù)層，放置在無菌玻璃或塑料片上，粘貼面朝上。用適宜的無菌多孔材料（如無菌紗布）覆蓋貼劑的粘貼面，以避免貼劑粘貼在一起。然后將其置于適宜體積并含有表面活性劑（如聚山梨酯80 或*）的稀釋劑中，用力振蕩至少30 分鐘，制成供試液。貼劑也可采用其他適宜的方法制備成供試液。

（6）具抑菌活性的供試品

當(dāng)供試品有抑菌活性時(shí)，采用下列方法進(jìn)行處理，以消除供試液的抑菌活性，再依法檢查。常用的方法如下。

① 培養(yǎng)基稀釋法   取規(guī)定量的供試液，至較大量的培養(yǎng)基中，使單位體積內(nèi)的供試品含量減少，至不含抑菌作用。測定細(xì)菌、霉菌及酵母菌的菌數(shù)時(shí)，取同稀釋級的供試液2ml ，每1ml供試液可等量分注多個(gè)平皿，傾注瓊脂培養(yǎng)基，混勻，凝固，培養(yǎng)，計(jì)數(shù)。每1ml供試液所注的平皿中生長的菌落數(shù)之和即為1ml的菌落數(shù)，計(jì)算每1ml供試液的平均菌落數(shù)，按平皿法計(jì)數(shù)規(guī)則報(bào)告菌數(shù)；控制菌檢查時(shí)，可加大*的用量。

② 離心沉淀法   取一定量的供試液，500 轉(zhuǎn)／分鐘離心3 分鐘，取全部上清液混合。用于細(xì)菌檢查。

③ 薄膜過濾法   見細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)項(xiàng)下的“薄膜過濾法"。

④ 中和法   凡含汞、砷或防腐劑等具有抑菌作用的供試品，可用適宜的中和劑或滅活劑消除其抑菌成分。中和劑或滅活劑可加在所用的稀釋液或培養(yǎng)基中。

細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)

計(jì)數(shù)培養(yǎng)基的適用性檢查

細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)用的培養(yǎng)基應(yīng)進(jìn)行培養(yǎng)基的適用性檢查，成品培養(yǎng)基、由脫水培養(yǎng)基或按處方配制的培養(yǎng)基均應(yīng)檢查。

菌種  

試驗(yàn)用菌株的傳代次數(shù)不得超過5 代（從菌種保藏中心獲得的冷凍干燥菌種為第0代），并采用適宜的菌種保藏技術(shù)進(jìn)行保存，以保證試驗(yàn)菌株的生物學(xué)特性。

大腸埃希菌（Escherichia coli[CMCC ( B ) 44l02]

*（Staphylococcus aureus）[ CMCC ( B ) 26003 ]

枯草芽抱桿菌（Bacillus subtilis  ) [ CMCC ( B ) 63501 ]

白色念珠菌（Candida albicans ）〔 CMCC ( F ) 98001 〕

黑曲霉（Aspergillus niger) [ CMCC ( F ) 98003 ]

菌液制備 

接種大腸埃希菌、*、枯草芽抱桿菌的新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中或營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，培養(yǎng)18 ～24 小時(shí)；接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基中或改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基上，培養(yǎng)24～48 小時(shí)。上述培養(yǎng)物用0 . 9 ％無菌氯化鈉溶液制成每lml 含菌數(shù)為50～100CFU 的菌懸液。接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)5 ～7 天，加人3 ～5ml 含0.05 % ( ml /ml ）聚山梨酯80 的0.9 ％無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然后，采用適宜的方法吸出孢子懸液至無菌試管內(nèi)，用含0.05 % ( ml / ml ）聚山梨酯80 的0.9％無菌氯化鈉溶液制成每lml 含孢子數(shù)50 ～ 100CFU 的孢子懸液。

菌液制備后若在室溫下放置，應(yīng)在2 小時(shí)內(nèi)使用；若保存在2～8 ℃ ，可在24 小時(shí)內(nèi)使用。黑曲霉孢子懸液可保存在2 ～8 ℃ ，在驗(yàn)證過的貯存期內(nèi)使用。

適用性檢查

取大腸埃希菌、*、枯草芽抱桿菌各50～100CFU ，分別注入無菌平皿中，立即傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗(yàn)菌平行制備2 個(gè)平皿，混勻，凝固，置30～35 ℃ 培養(yǎng)48 小時(shí)，計(jì)數(shù)；取白色念珠菌、黑曲霉各50～100CFU ，分別注入無菌平皿中，立即傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗(yàn)菌平行制備2 個(gè)平皿，混勻，凝固，置23 ～28 ℃ 培養(yǎng)72 小時(shí)，計(jì)數(shù)；取白色念珠菌50 ～100CFU ，注入無菌平皿中，立即傾注酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基．平行制備2 個(gè)平皿，混勻，凝固，置23 ～28 ℃ 培養(yǎng)72 小時(shí)，計(jì)數(shù)。同時(shí)，用相應(yīng)的對照培養(yǎng)基替代被檢培養(yǎng)基進(jìn)行上述試驗(yàn)。

結(jié)果判定 

若被檢培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)不小于對照培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)的70 % ，且菌落形態(tài)大小與對照培養(yǎng)基上的菌落一致，判該培養(yǎng)基的適用性檢查符合規(guī)定。

計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證

當(dāng)建立產(chǎn)品的微生物限度檢查法時(shí)，應(yīng)進(jìn)行細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證，以確認(rèn)所采用的方法適合于該產(chǎn)品的細(xì)菌、霉菌及酵母菌數(shù)的測定。若產(chǎn)品的組分或原檢驗(yàn)條件發(fā)生改變可能影響檢驗(yàn)結(jié)果時(shí)，計(jì)數(shù)方法應(yīng)重新驗(yàn)證。

驗(yàn)證時(shí)，按供試液的制備和細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)所規(guī)定的方法及下列要求進(jìn)行。對各試驗(yàn)菌的回收率應(yīng)逐一進(jìn)行驗(yàn)證。

菌種及菌液制備 

同計(jì)數(shù)培養(yǎng)鑒的適用性檢查。

驗(yàn)證方法

驗(yàn)證試驗(yàn)至少應(yīng)進(jìn)行3 次獨(dú)立的平行試驗(yàn)，并分別計(jì)算各試驗(yàn)菌每次試驗(yàn)的回收率。

( l )試驗(yàn)組   平皿法計(jì)數(shù)時(shí)，取試驗(yàn)可能用的zui低稀釋級供試液lml 和50 ～100CFU 試驗(yàn)菌，分別注人平皿中，立即傾注瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗(yàn)菌平行制備2 個(gè)平皿，按平皿法測定其菌數(shù)。薄膜過濾法計(jì)數(shù)時(shí)，取規(guī)定量試驗(yàn)可能用的zui低稀釋級供試液，過濾，沖洗，在zui后一次的沖洗液中加人50～100CFU 試驗(yàn)菌，過濾，按薄膜過濾法測定其菌數(shù)。

( 2 )菌液組   測定所加的試驗(yàn)菌數(shù)。

( 3 )供試品對照組   取規(guī)定量供試液，按菌落計(jì)數(shù)方法測定供試品本底菌數(shù)。

( 4 )稀釋劑對照組   若供試液制備需要分散、乳化、中和、離心或薄膜過濾等特殊處理時(shí)，應(yīng)增加稀釋劑對照組，以考察供試液制備過程中微生物受影響的程度。試驗(yàn)時(shí)，可用相應(yīng)的稀釋液替代供試品，加入試驗(yàn)菌，使zui終菌濃度為每lml 供試液含50 ～100CFU ，按試驗(yàn)組的供試液制備方法和菌落計(jì)數(shù)方法測定其菌數(shù)。

結(jié)果判斷 

在3 次獨(dú)立的平行試驗(yàn)中，稀釋劑對照組的菌數(shù)回收率（稀釋劑對照組的平均菌落數(shù)占菌液組的平均菌落數(shù)的百分率）應(yīng)均不低于70 % 。若試驗(yàn)組的菌數(shù)回收率（試驗(yàn)組的平均菌落數(shù)減去供試品對照組的平均菌落數(shù)的值占菌液組的平均菌落數(shù)的百分率）均不低于70％，照該供試液制備方法和計(jì)數(shù)法測定供試品的細(xì)菌、霉菌及酵母菌數(shù)；若任一次試驗(yàn)中試驗(yàn)組的菌數(shù)回收率低于70 % ，應(yīng)采用培養(yǎng)基稀釋法、離心沉淀法、薄膜過濾法、中和法（常見干擾物的中和劑或滅活方法見表1 ）等方法或聯(lián)合使用這些方法消除供試品的抑菌活性，并重新進(jìn)行方法驗(yàn)證。

表l 常見干擾物的中和劑或滅活方法

若沒有適宜的方法消除供試品的抑菌活性，那么驗(yàn)證試驗(yàn)中微生物回收的失敗可看成是因供試品的抗菌活性引起的，同時(shí)表明該供試品不能被試驗(yàn)菌污染。但是，供試品也可能僅對試驗(yàn)用菌株具有抑制作用，而對其他菌株沒有抑制作用。因此，根據(jù)供試品須符合的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)和菌數(shù)報(bào)告規(guī)則，在不影響檢驗(yàn)結(jié)果判斷的前提下，應(yīng)采用能使微生物生長的更高稀釋級的供試液進(jìn)行方法驗(yàn)證試驗(yàn)。若驗(yàn)證試驗(yàn)符合要求，應(yīng)以該稀釋級供試液作為zui低稀釋級的供試液進(jìn)行供試品檢驗(yàn)。

計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證時(shí)，采用上述方法若還存在一株或多株試驗(yàn)菌的回收率達(dá)不到要求，那么選擇回收率zui接近要求的方法和試驗(yàn)條件進(jìn)行供試品的檢驗(yàn)。

驗(yàn)證試驗(yàn)也可與供試品的細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)同時(shí)進(jìn)行。

供試品檢查

計(jì)數(shù)方法包括平皿法和薄膜過濾法。檢查時(shí)，按已驗(yàn)證的計(jì)數(shù)方法進(jìn)行供試品的細(xì)菌、霉菌及酵母菌菌數(shù)的測定。

按計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證試驗(yàn)確認(rèn)的程序進(jìn)行供試液制備。用稀釋液稀釋成1 : 10 、1:l0² 、l:10³ 等稀釋級的供試液。

1 ．平皿法

根據(jù)菌數(shù)報(bào)告規(guī)則取相應(yīng)稀釋級的供試液lml ，置直徑90mm 的無菌平皿中，注人15 ～ 20ml 溫度不超過45 ℃ 的溶化的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基或酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，混勻，凝固，倒置培養(yǎng)。每稀釋級每種培養(yǎng)基至少制備2 個(gè)平板。

陰性對照試驗(yàn) 

取試驗(yàn)用的稀釋液lml ，置無菌平皿中．注入培養(yǎng)基，凝固，倒置培養(yǎng)。每種計(jì)數(shù)用的培養(yǎng)基各制備2 個(gè)平板，均不得有菌生長。

培養(yǎng)和計(jì)數(shù)

除另有規(guī)定外，細(xì)菌培養(yǎng)3 天，霉菌、酵母菌培養(yǎng)5 天，逐日觀察菌落生長情況，點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)，必要時(shí)，可適當(dāng)延長培養(yǎng)時(shí)間至7 天進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)并報(bào)告。菌落蔓延生長成片的平板不宜計(jì)數(shù)。點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)后，計(jì)算各稀釋級供試液的平均菌落數(shù)，按菌數(shù)報(bào)告規(guī)則報(bào)告菌數(shù)。若同稀釋級兩個(gè)平板的菌落平均數(shù)不小于15 ．則兩個(gè)平板的菌落數(shù)不能相差l 倍或以上。

一般營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基用于細(xì)菌計(jì)數(shù)；玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基用于霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)；酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基用于酵母菌計(jì)數(shù)。在特殊情況下．若營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上長有霉菌和酵母菌、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基上長有細(xì)菌，則應(yīng)分別點(diǎn)計(jì)霉菌和酵母菌、細(xì)菌菌落數(shù)。然后將營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上的霉菌和酵母菌數(shù)或玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基上的細(xì)菌數(shù)，與玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基中的霉菌和酵母菌數(shù)或營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中的細(xì)菌數(shù)進(jìn)行比較，以菌落數(shù)高的培養(yǎng)基中的菌數(shù)為計(jì)數(shù)結(jié)果。

含蜂蜜、王漿的液體制劑，用玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基測定霉菌數(shù)，用酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基測定酵母菌數(shù)，合并計(jì)數(shù)。

菌數(shù)報(bào)告規(guī)則

細(xì)菌、酵母菌宜選取平均菌落數(shù)小于300CFU 、霉菌宜選取平均菌落數(shù)小于100CFU 的稀釋級，作為菌數(shù)報(bào)告（取兩位有效數(shù)字）的依據(jù)。以zui高的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)的值報(bào)告1g、lml 或10cm²供試品中所含的菌數(shù)。

如各稀釋級的平板均無菌落生長，或僅zui低稀釋級的平板有菌落生長，但平均菌落數(shù)小于1 時(shí)，以＜1 乘以zui低稀釋倍數(shù)的值報(bào)告菌數(shù)。

2 ．薄膜過濾法

采用薄膜過濾法，濾膜孔徑應(yīng)不大于0.45μm ，直徑一般為50mm ，若采用其他直徑的濾膜．沖洗量應(yīng)進(jìn)行相應(yīng)的調(diào)整。選擇濾膜材質(zhì)時(shí)應(yīng)保證供試品及其溶劑不影響微生物的充分被截留。濾器及濾膜使用前應(yīng)采用適宜的方法滅菌。使用時(shí)，應(yīng)保證濾膜在過濾前后的完整性。水溶性供試液過濾前先將少量的沖洗液過濾以潤濕濾膜。油類供試品，其濾膜和濾器在使用前應(yīng)充分干燥。為發(fā)揮濾膜的zui大過濾效率，應(yīng)注意保持供試品溶液及沖洗液覆蓋整個(gè)濾膜表面。供試液經(jīng)薄膜過濾后，若需要用沖洗液沖洗濾膜，每張濾膜每次沖洗量為100ml ?？倹_洗量不得超過1000ml.， 以避免濾膜上的微生物受損傷。

取相當(dāng)于每張濾膜含lg 、lml或10cm²供試品的供試液，加至適量的稀釋劑中，混勻，過濾。若供試品每1g 、lml 或10 cm²所含的菌數(shù)較多時(shí)，可取適宜稀釋級的供試液lml 進(jìn)行試驗(yàn)。用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或其他適宜的沖洗液沖洗濾膜，沖洗方法和沖洗量同“計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證"。沖洗后取出濾膜，菌面朝上貼于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基或酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)。每種培養(yǎng)基至少制備一張濾膜。

陰性對照試驗(yàn)

取試驗(yàn)用的稀釋液lml，照上述薄膜過濾法操作，作為陰性對照。陰性對照不得有菌生長。

培養(yǎng)和計(jì)數(shù) 

培養(yǎng)條件和計(jì)數(shù)方法同平皿法，每片濾膜上的菌落數(shù)應(yīng)不超過100CFU 。

菌數(shù)報(bào)告規(guī)則

以相當(dāng)于1g 、lml或10cm² 供試品的菌落數(shù)報(bào)告菌數(shù)；若濾膜上無菌落生長，以＜1 報(bào)告菌數(shù)（每張濾膜過濾1g、lml 或10cm²供試品），或＜l 乘以稀釋倍數(shù)的值報(bào)告菌數(shù)。
控制菌檢查

控制菌檢查用培養(yǎng)基的適用性檢查

控制菌檢查用的培養(yǎng)基應(yīng)進(jìn)行培養(yǎng)基的適用性檢查，成品培養(yǎng)基、由脫水培養(yǎng)基或按處方配制的培養(yǎng)基均應(yīng)檢查。
菌種

對試驗(yàn)菌種的要求同計(jì)數(shù)培養(yǎng)基的適用性檢查。

大腸埃希菌（Escherichia coli）[CMCC ( B ) 44l02]

*（Staphylococcus aureus）[ CMCC ( B ) 26003 ]

乙型副傷寒沙門菌（Salmonella paratyphi B ) 〔 CMCC ( B ) 50094 〕

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa ）〔 CMCC ( B ) 10104 〕

生孢梭菌（Clostridium sporogenes ) [ CMCC ( B ) 6494l]

白色念珠菌（Candida albicans ）〔 CMCC ( F ) 98001 〕

菌液制備 

接種大腸埃希菌、*、乙型副傷寒沙門菌、銅綠假單胞菌的新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中或營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，生孢梭菌的新鮮培養(yǎng)物至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)18 ～24 小時(shí)；接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基中或改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基上，培養(yǎng)24 ～48 小時(shí)。用0.9 ％無菌氯化鈉溶液制成每lml 含菌數(shù)為10 ～100CFU 的菌懸液。

菌懸液在室溫下放置應(yīng)在2 小時(shí)內(nèi)使用．若保存在2～8 ℃ 可在24 小時(shí)內(nèi)使用。

適用性檢查 

控制菌檢查用培養(yǎng)基的適用性檢查項(xiàng)目包括促生長能力、抑制能力及指示能力的檢查。各培養(yǎng)基的檢測項(xiàng)目及所用菌株見表2。

表2 控制菌檢查用培養(yǎng)基的促生長能力、抑制能力及指示能力檢查

液體培養(yǎng)基促生長能力檢查 

分別接種不大于100CFU 的試驗(yàn)菌（表2） 于被檢培養(yǎng)基和對照培養(yǎng)基中，在相應(yīng)控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度及zui短培養(yǎng)時(shí)間下培養(yǎng)。與對照培養(yǎng)基管比較，被檢培養(yǎng)基管試驗(yàn)菌應(yīng)生長良好。

固體培養(yǎng)墓促生長能力檢查

取試驗(yàn)菌各0.1ml （含菌數(shù)50～100CFU ）分別涂布于被檢培養(yǎng)基和對照培養(yǎng)基平板上，在相應(yīng)控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度及zui短培養(yǎng)時(shí)間下培養(yǎng)。被檢培養(yǎng)基與對照培養(yǎng)基上生長的菌落大小、形態(tài)特征應(yīng)一致。

培養(yǎng)基抑制能力檢查 

接種不少于100CFU 的試驗(yàn)菌（表2 ）于被檢培養(yǎng)基中，在相應(yīng)控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度及zui長時(shí)間下培養(yǎng)，試驗(yàn)菌應(yīng)不得生長。

固體培養(yǎng)基指示能力檢查

取試驗(yàn)菌各0.1ml （含菌數(shù)不大于100CFU ) （表2 ）分別涂布于被檢培養(yǎng)基和對照培養(yǎng)基平板上，在相應(yīng)控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度及時(shí)間下培養(yǎng)。被檢培養(yǎng)基上試驗(yàn)菌生長的菌落大小、形態(tài)特征、指示劑反應(yīng)情況等應(yīng)與對照培養(yǎng)基一致。

液體培養(yǎng)基指示能力檢查 

分別接種不大于100CFU 的試驗(yàn)菌（表2 ）于被檢培養(yǎng)基和對照培養(yǎng)基中，在相應(yīng)控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度及zui短培養(yǎng)時(shí)間下培養(yǎng)。與對照培養(yǎng)基管比較，被檢培養(yǎng)基管試驗(yàn)菌生長情況、指示劑反應(yīng)等應(yīng)與對照培養(yǎng)基一致。

控制菌檢查方法的驗(yàn)證

當(dāng)建立產(chǎn)品的微生物限度檢查法時(shí)，應(yīng)進(jìn)行控制菌檢查方法的驗(yàn)證，以確認(rèn)所采用的方法適合于該產(chǎn)品的控制菌檢查。若產(chǎn)品的組分或原檢驗(yàn)條件發(fā)生改變可能影響檢驗(yàn)結(jié)果時(shí)，檢查方法應(yīng)重新驗(yàn)證。

驗(yàn)證時(shí)，依各品種項(xiàng)下微生物限度標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定檢查的控制菌選擇相應(yīng)驗(yàn)證的菌株，驗(yàn)證大腸菌群檢查法時(shí)，采用大腸埃希菌作為驗(yàn)證菌株。驗(yàn)證試驗(yàn)按供試液的制備和控制菌檢查法的規(guī)定及下列要求進(jìn)行。

菌種及菌液制備

同控制菌檢查用培養(yǎng)基的適用性檢查。

驗(yàn)證方法

取規(guī)定量供試液及10 ～100CFU 試驗(yàn)菌加入*中，依相應(yīng)控制菌檢查法進(jìn)行檢查。當(dāng)采用薄膜過濾法時(shí)．取規(guī)定量供試液，過濾，沖洗，試驗(yàn)菌應(yīng)加在zui后一次沖洗液中，過濾后，注入增菌培養(yǎng)荃或取出濾膜接人*中。

結(jié)果判斷

若上述試驗(yàn)檢出試驗(yàn)菌，按此供試液制備法和控制菌檢查法進(jìn)行供試品的該控制菌檢查；若未檢出試驗(yàn)菌，應(yīng)采用培養(yǎng)基稀釋法、離心沉淀法、薄膜過濾法、中和法等方法或聯(lián)合使用這些方法消除供試品的抑菌活性，并重新進(jìn)行方法驗(yàn)證。

驗(yàn)證試驗(yàn)也可與供試品的控制菌檢查同時(shí)進(jìn)行。

供試品檢查

供試品的控制菌檢查應(yīng)按已驗(yàn)證的方法進(jìn)行。

陽性對照試驗(yàn) 

陽性對照試驗(yàn)方法同供試品的控制菌檢查，對照菌的加菌量為10～10OCFU 。陽性對照試驗(yàn)應(yīng)檢出相應(yīng)的控制菌。

陰性對照試驗(yàn)

取稀釋液10ml 照相應(yīng)控制菌檢查法檢查，作為陰性對照。陰性對照應(yīng)無菌生長，

（1）大腸埃希菌（Escherichia coli ）   取供試液10ml （相當(dāng)于供試品lg 、lml 、10cm² ) ，直接或處理后接種至適量（不少于100ml ）的膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)18～ 24 小時(shí)，必要時(shí)可延長至48 小時(shí)。

取上述培養(yǎng)物0.2ml ，接種至含5ml MUG 培養(yǎng)基的試管內(nèi)，培養(yǎng)，于5 小時(shí)、24 小時(shí)在366nm 紫外光下觀察，同時(shí)用未接種的MUG 培養(yǎng)基作本底對照。若管內(nèi)培養(yǎng)物呈現(xiàn)熒光，為MUG 陽性；不呈現(xiàn)熒光，為MUG 陰性。觀察后，沿培養(yǎng)管的管壁加人數(shù)滴靛基質(zhì)試液，液面呈玫瑰紅色，為靛基質(zhì)陽性；呈試劑本色，為靛基質(zhì)陰性。本底對照應(yīng)為MUG 陰性和靛基質(zhì)陰性。

如MUG 陽性、靛基質(zhì)陽性，判供試品檢出大腸埃希菌；如MUG 陰性、靛基質(zhì)陰性，判供試品未檢出大腸埃希菌；如MUG 陽性、靛基質(zhì)陰性，或MUG 陰性、靛基質(zhì)陽性，則應(yīng)取膽鹽乳糖培養(yǎng)基的培養(yǎng)物劃線接種于曙紅*瓊脂培養(yǎng)基或麥康凱瓊脂培養(yǎng)基的平板上，培養(yǎng)18～24 小時(shí)。

若平板上無菌落生長或生長的菌落與表3 所列的菌落形態(tài)特征不符，判供試品未檢出大腸埃希菌。若平板上生長的菌落與表3 所列的菌落形態(tài)特征相符或疑似，應(yīng)進(jìn)行分離、純化、染色鏡檢和適宜的鑒定試驗(yàn)，確認(rèn)是否為大腸埃希菌。

表3 大腸埃希菌菌落形態(tài)特征

（2）大腸菌群（Coliform ）   取含適量（不少于10ml ) 的乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基管3 支，分別加入1 :10 的供試液lml（含供試品0.1g或0.1ml）、1: 100 的供試液1ml（含供試品0.01g或0.01ml）、1:1000的供試液1 ml（含供試品0.001g或0.001ml），另取1 支乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基管加人稀釋液1ml作為陰性對照管。培養(yǎng)18～24 小時(shí)。

乳糖膽鹽發(fā)酵管若無菌生長或有菌生長但不產(chǎn)酸產(chǎn)氣，判該管未檢出大腸菌群；若產(chǎn)酸產(chǎn)氣，應(yīng)將發(fā)酵管中的培養(yǎng)物分別劃線接種于曙紅*瓊脂培養(yǎng)基或麥康凱瓊脂培養(yǎng)墓的平板上，培養(yǎng)18～24 小時(shí)。

若平板上無菌落生長，或生長的菌落與表4 所列的菌落形態(tài)特征不符或?yàn)榉歉锾m氏陰性無芽抱桿菌，判該管未檢出大腸菌群；若平板上生長的菌落與表4 所列的菌落形態(tài)特征相符或疑似，且為革蘭氏陰性無芽抱桿菌，應(yīng)進(jìn)行確證試驗(yàn)。
表4 大腸菌群菌落形態(tài)特征

確證試驗(yàn)  從上述分離平板上挑選4 ～ 5 個(gè)疑似菌落，分別接種于乳糖發(fā)酵管中，培養(yǎng)24 ～ 48 小時(shí)。若產(chǎn)酸產(chǎn)氣，判該乳糖膽鹽發(fā)醉管檢出大腸菌群，否則判未檢出大腸菌群。

根據(jù)大腸菌群的檢出管數(shù)，按表5 報(bào)告lg 或lml 供試品中的大腸菌群數(shù)。

表5 可能的大腸菌群數(shù)

注：＋代表檢出大腸菌群；―代表未檢出大腸菌群．

（3）沙門菌（salmonella ）   取供試品10g或10ml , 直接或處理后接種至適量（不少于200ml）的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，用勻漿儀或其他適宜方法混勻，培養(yǎng)18～24 小時(shí)。

取上述培養(yǎng)物1ml ，接種于10 ml四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基中，培養(yǎng)18 ～24 小時(shí)后，分別劃線接種于膽鹽硫乳瓊脂（或沙門、志賀菌屬瓊脂）培養(yǎng)基和麥康凱瓊脂（或曙紅*瓊脂）培養(yǎng)基的平板上，培養(yǎng)18 ～24 小時(shí)（必要時(shí)延長至40～ 48 小時(shí)）。若平板上無菌落生長或生長的菌落不同于表6 所列的特征，判供試品未檢出沙門菌。

若平板上生長的菌落與表6 所列的菌落形態(tài)特征相符或疑似，用接種針挑選2 ～3 個(gè)菌落分別于三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基高層斜面上進(jìn)行斜面和高層穿刺接種，培養(yǎng)18 ～24 小時(shí)，如斜面未見紅色、底層未見黃色；或斜面黃色、底層無黑色，判供試品未檢出沙門菌。否則，應(yīng)取三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基斜面的培養(yǎng)物進(jìn)行適宜的鑒定試驗(yàn)，確認(rèn)是否為沙門菌。

表6沙門菌菌落形態(tài)特征

（4）銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa ）   取供試液10ml （相當(dāng)于供試品1g 、lml 、10cm² ) ，直接或處理后接種至適量（不少于100ml ）的膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)18 ～24 小時(shí)。取上述培養(yǎng)物，劃線接種于溴化十六烷基*銨瓊脂培養(yǎng)基的平板上，培養(yǎng)18～24 小時(shí)。

銅綠假單胞菌典型菌落呈扁平、無定形、周邊擴(kuò)散、表面濕潤，灰白色，周圍時(shí)有藍(lán)綠色素?cái)U(kuò)散。如平板上無菌落生長或生長的菌落與上述菌落形態(tài)特征不符，判供試品未檢出銅綠假單胞菌。如平板生長的菌落與上述菌落形態(tài)特征相符或疑似，應(yīng)挑選2 ～3 個(gè)菌落，分別接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)18～ 24 小時(shí)。取斜面培養(yǎng)物進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢及氧化酶試驗(yàn)。

氧化酶試驗(yàn) 

取潔凈濾紙片置于平皿內(nèi)，用無菌玻棒取斜面培養(yǎng)物涂于濾紙片上，滴加新配制的1％二鹽酸二甲基對苯二胺試液，在30 秒內(nèi)若培養(yǎng)物呈粉紅色并逐漸變?yōu)樽霞t色為氧化酶試驗(yàn)陽性，否則為陰性。

若斜面培養(yǎng)物為非革蘭氏陰性無芽抱桿菌或氧化酶試驗(yàn)陰性，均判供試品未檢出銅綠假單胞菌。否則，應(yīng)進(jìn)行綠膿菌素試驗(yàn)。

綠膿菌素（Pyocyanin ）試驗(yàn) 

取斜面培養(yǎng)物接種于PDP 瓊脂培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)24 小時(shí)，加三氯甲烷3 ～5ml至培養(yǎng)管中，攪碎培養(yǎng)基并充分振搖。靜置片刻，將三氯甲烷相移至另一試管中，加人lmol / L 鹽酸試液約lml ，振搖后，靜置片刻，觀察。若鹽酸溶液呈粉紅色，為綠膿菌素試驗(yàn)陽性，否則為陰性。同時(shí)用未接種的PDP 瓊脂培養(yǎng)基斜面同法作陰性對照，陰性對照試驗(yàn)應(yīng)呈陰性。

若上述疑似菌為革蘭氏陰性桿菌、氧化酶試驗(yàn)陽性及綠膿菌素試驗(yàn)陽性，判供試品槍出銅綠假單胞菌。若上述疑似菌為革蘭陰性桿菌、氧化酶試驗(yàn)陽性及綠膿菌素試驗(yàn)陰性，應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行適宜的鑒定試驗(yàn)，確認(rèn)是否為銅綠假單胞菌。

( 5 )*（Staphylococcus aureus ）取供試液l0ml （相當(dāng)于供試品1g、lml 、l0cm² ) ，直接或處理后接種至適見（不少于100ml）的亞碲酸鈉（鉀）肉湯（或營養(yǎng)肉湯）培養(yǎng)基中，培養(yǎng)18 ～24 小時(shí)，必要時(shí)可延長至48 小時(shí)。取上述培養(yǎng)物，劃線接種于卵黃氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基或*氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基的平板上，培養(yǎng)24 ～72 小時(shí)。若平板上無菌落生長或生長的菌落不同于表7 所列特征，判供試品未檢出*。

表7*菌落形態(tài)特征

若平板上生長的菌落與表7 所列的菌落特征相符或疑似，應(yīng)挑選2 ～3 個(gè)菌落，分別接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)18～24 小時(shí)。取營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)物進(jìn)行革蘭氏染色．并接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，培養(yǎng)18～24 小時(shí)，做血漿凝固酶試驗(yàn)。

血漿凝固酶試驗(yàn)

取滅菌小試管3 支，各加入血漿和無菌水混合液（1 : 1 ) 0.5ml ，再分別加入可疑菌株的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物（或由營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)物制備的濃菌懸液）0.5ml 、*營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物（或由營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)物制備的濃菌懸液）0.5ml 、營養(yǎng)肉湯或0.9％無菌氯化鈉溶液0.5ml , 即為試驗(yàn)管、陽性對照管和陰性對照管。將3 管同時(shí)培養(yǎng)，3 小時(shí)后開始觀察直至24 小時(shí)。陰性對照管的血漿應(yīng)流動自如，陽性對照管血漿應(yīng)凝固，若試驗(yàn)管血漿凝固為血漿凝固酶試驗(yàn)陽性，否則為陰性。如陽性對照管或陰性對照管不符合規(guī)定時(shí)，應(yīng)另制備血漿，重新試驗(yàn)。

若上述疑似菌為非革蘭氏陽性球菌、血漿凝固酶試驗(yàn)陰性，判供試品未檢出*。

( 6 )梭菌（Clostridium ）   取供試液10ml （相當(dāng)于供試品1g 、lml 、10cm² ) 2 份，其中l(wèi) 份置80 ℃ 保溫10 分鐘后迅速冷卻。上述2 份供試液直接或處理后分別接種至100ml 的梭菌*中。置厭氧條件下培養(yǎng)48 小時(shí)。取上述每一培養(yǎng)物0.2ml ，分別涂抹接種于含*的哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基平板上，置厭氧條件下培養(yǎng)48～72 小時(shí)。若平板上無菌落生長，判供試品未檢出梭菌；若平板上有菌落生長，應(yīng)挑選2 ～3 個(gè)菌落分別進(jìn)行革蘭氏染色和過氧化氫酶試驗(yàn)。

過氧化氫酶試驗(yàn)

取七述平板上的菌落，置潔凈玻片上，滴加3 ％過氧化氫試液，若菌落表面有氣泡產(chǎn)生，為過氧化氫酶試驗(yàn)陽性，否則為陰性。

若上述可疑菌落為革蘭氏陽性梭菌，有或無卵圓形或球形的芽孢，過氧化氫酶試驗(yàn)陰性，判供試品檢出梭菌，否則判供試品未檢出梭菌。

( 7 )白色念珠菌（Candida albicans）  取供試液10ml （相當(dāng)于供試品1g 、lml 、l0cm²）直接或處理后接種至適量（不少于10Oml）的沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48 ～72 小時(shí)。取上述培養(yǎng)物劃線接種于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)24 ～48 小時(shí)（必要時(shí)延長至72 小時(shí)）。

白色念珠菌在沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上生長的菌落呈乳白色，偶見淡黃色，表面光滑有濃酵母氣味，培養(yǎng)時(shí)間稍久則菌落增大，顏色變深、質(zhì)地變硬或有皺褶。若平板上無菌落生長或生長的菌落與上述菌落形態(tài)特征不符，判供試品未檢出白色念珠菌。如平板上生長的菌落與上述菌落形態(tài)特征相符或疑似，應(yīng)挑選2 ～ 3 個(gè)菌落分別接種至念珠菌顯色培養(yǎng)基平板上 ，培養(yǎng)24～48 小時(shí)（必要時(shí)延長至72 小時(shí)）。若平板上無綠色或翠綠色的菌落生長，判供試品未檢出白色念珠菌。

若平板上生長的菌落為綠色或翠綠色．挑取相符或疑似的菌落接種于1%聚山梨酯80-玉米瓊脂培養(yǎng)基上．培養(yǎng)24～48 小時(shí)。取培養(yǎng)物進(jìn)行染色、鏡檢及芽管試驗(yàn)。

芽管試驗(yàn) 

挑取l％聚山梨酯80-玉米瓊脂培養(yǎng)基上的培養(yǎng)物，接種于加有一滴血清的載玻片上，蓋上蓋玻片，置濕潤的平皿內(nèi)，于35～ 37 ℃ 培養(yǎng)1 ～3 小時(shí)，置顯微鏡下觀察孢子上有否長出短小芽管。

若上述疑似菌為非革蘭氏陽性菌，顯微鏡下未見厚膜孢子、假菌絲、芽管，判供試品未檢出白色念珠菌。

結(jié)果判斷

供試品檢出控制菌或其他致病菌時(shí)，按一次檢出結(jié)果為準(zhǔn)，不再復(fù)試。

供試品的細(xì)菌數(shù)、霉菌和酵母菌數(shù)其中任何一項(xiàng)不符合該品種項(xiàng)下的規(guī)定，應(yīng)從同一批樣品中隨機(jī)抽樣，獨(dú)立復(fù)試兩次，以3 次結(jié)果的平均值報(bào)告菌數(shù)。

若供試品的細(xì)菌數(shù)、霉菌和酵母菌數(shù)及控制菌三項(xiàng)檢驗(yàn)結(jié)果均符合該品種項(xiàng)下的規(guī)定，判供試品符合規(guī)定；若其中任何一項(xiàng)不符合該品種項(xiàng)下的規(guī)定．判供試品不符合規(guī)定。

稀釋液

稀釋液配制后，應(yīng)采用驗(yàn)證合格的滅菌程序滅菌。

1 .pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液

照無菌檢查法（附錄XII A ）制備。

2.pH6.8無菌磷酸鹽緩沖液、pH7.6無菌磷酸鹽緩沖液

按緩沖液（二部附錄XV D ）配制后，過濾，分裝，滅菌。

如需要，可在上述稀釋液滅菌前或滅菌后加入表面活性劑或中和劑等。

3.0.9％無菌氯化鈉溶液

取氯化鈉9.0g，加水溶解使成1000ml ，過濾，分裝，滅菌。

培養(yǎng)基及其制備方法

培養(yǎng)基可按以下處方制備，也可使用按該處方生產(chǎn)的符合要求的脫水培養(yǎng)基。配制后，應(yīng)采用驗(yàn)證合格的滅菌程序滅菌。

1.營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基、改良馬丁培養(yǎng)基及改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基

照無菌檢查法（附錄XII A ）制備。

2.玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基

胨                       5.0g

玫瑰紅鈉                 0.0133g

葡萄糖                   10.0g

瓊脂                     14.0g

磷酸二氫鉀               1.0g

水                       1000ml

*                   0.5g

除葡萄糖、玫瑰紅鈉外，取上述成分，混合，微溫溶解，濾過，加入葡萄糖、玫瑰紅鈉，分裝．滅菌。

3.酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（YPD )

胨                    10.0g

瓊脂                  14.0g

酵母浸出粉            5.0g

水                    1000ml

葡萄糖                20.0g

除葡萄糖外，取上述成分．混合，微溫溶解，濾過，加人葡萄糖，分裝．滅菌。

4 ．膽鹽乳糖培養(yǎng)基(BL ) 
胨                      20.0g

磷酸二氫鉀              1.3g

乳糖                    5.0g

牛膽鹽                   2.0g

氯化鈉                   5.0g

（或去氧膽酸鈉）         ( 0.5g)

*              4.0g

水                      1000ml

除乳糖、牛膽鹽或去氧膽酸鈉外，取上述成分，混合，微溫溶解，調(diào)節(jié)pH 值使滅菌后為7.4 ±0.2 ，煮沸，濾清，加人乳糖、牛膽鹽或去氧膽酸鈉，分裝，滅菌。

5.乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基

胨                                  20.0g

0.04 ％溴甲酚紫指示液               25ml

乳糖                                10.0g

水                                  l000ml

牛膽鹽                              5.0g

除0.04 ％溴甲酚紫指示液外，取上述成分，混合，微溫溶解，調(diào)節(jié)pH 值使滅菌后為7.4 ±0.2 ，加人0.04 ％溴甲酚紫指示液，根據(jù)要求的用量分裝于含倒管的試管中。滅菌。所用倒管的規(guī)格應(yīng)保證產(chǎn)氣結(jié)果的觀察。

6．曙紅*瓊脂培養(yǎng)基（EMB )

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基               100ml

曙紅鈉指示液                 2ml

20 ％乳糖溶液                5ml

*指示液                 1.3～1.6ml

取營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，加熱溶化后，冷至60℃ ，按無菌操作加入滅菌的其他3 種溶液，搖勻，傾注平皿。

7.麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（ MacC）
胨                             20.0g

1 ％中性紅指示液              3ml

乳糖                           10.0g

瓊脂                           14.0g

牛膽鹽                         5.0g

水                             l000ml

氯化鈉                         5.0g

除乳糖、1 ％中性紅指示液、牛膽鹽及瓊脂外，取上述成分，混合，微溫溶解，調(diào)節(jié)pH 值使滅菌后為7.2 ±0.2 ，加入瓊脂，加熱溶化后，再加入其余各成分，搖勻，分裝，滅菌，冷至約60℃ ，傾注平皿。

8. 4 -甲基傘形酮葡糖昔酸（4-methylumbelliferyl-β-D-glucuionide，MUG）培養(yǎng)基

胨                                10.0g

磷酸二氫鉀（無水）                 0.9g

硫酸錳                            0.5mg

*（無水）                 6.2g

硫酸鋅                            0.5mg

亞硫酸鈉                          40mg

*                            0.1g

去氧膽酸鈉                        1.0g

氯化鈉                            5.0g

MUG                              75mg

氯化鈣                            50mg

水                                l000ml

除MUG 外，取上述成分，混合，微溫溶解，調(diào)節(jié)pH 值使滅菌后為7.3±0.1，加人MUG ，溶解，每管分裝5ml ，滅菌。

9.三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基（TSI )

胨                      20.0g

牛肉浸出粉              5.0g

乳糖                    10.0g

蔗糖                    10.0g

葡萄糖                  1.0g

氯化鈉                  5.0g

*                0.2g

*              0.2g

0.2 ％酚磺酞指示液        12.5ml

瓊脂                      12.0g

水                        1000ml

除三種糖、0.2％酚磺酞指示液、瓊脂外，取上述成分，混合，微溫溶解，調(diào)節(jié)pH 值使滅菌后為7.3±0.1, 加入瓊脂，加熱溶化后，再加入其余各成分，搖勻，分裝，滅菌，制成高底層（2 ～3cm ）短斜面。

10 ．四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基（TTB）

胨                      5.0g

*              30.0g

牛膽鹽                  1.0g

水                      l000ml

碳酸鈣                  10.0g

取上述成分，混合，微溫溶解，滅菌。

臨用前，取上述培養(yǎng)基，每10ml 加入碘試液0.2ml 和亮綠試液0.lml ，混勻。

11.沙門、志賀菌屬瓊脂培養(yǎng)基（SS）

胨                        5.0g

*                8.5g

牛肉浸出粉                5.0g

中性紅指示液              2.5ml

乳糖                      10.0g

亮綠試液                  0.33ml

牛膽鹽                    8.5g

瓊脂                      16.0g

*                  8.5g

水                        1000ml

*                1.0g

除乳糖、中性紅指示液、瓊脂外，取上述成分，混合，微溫溶解，調(diào)節(jié)pH 值使滅菌后為7.2±0.1,濾過，加入瓊脂，加熱溶化后，再加入其余各成分，搖勻，滅菌，冷至60℃ ，傾注平皿。

12 ．膽鹽硫乳瓊脂培養(yǎng)基（DHL )

胨                          20.0g

*                    1.0g

牛肉浸出粉                  3.0g

*                  1.0g

乳糖                        10.0g

中性紅指示液                3ml

蔗糖                        10.0g

瓊脂                        16.0g

去氧膽酸鈉                  1.0g

水                           l000ml

*                   2.3g

除糖、指示液及瓊脂外，取上述成分，混合，微溫溶解，調(diào)節(jié)pH 值使滅菌后為7.2±0.1,加入瓊脂，加熱溶化后，再加人其余成分，搖勻，冷至60 ℃ ，傾注平皿。

13.溴化十六烷基*銨瓊脂培養(yǎng)基

胨                             10.0g

溴化十六烷基*銨             0.3g

牛肉浸出粉                     3.0g

瓊脂                           14.0g

氯化鈉                         5.0g

水                             l000ml

除瓊脂外，取上述成分，混合，微溫溶解，調(diào)節(jié)pH 值使滅菌后為7.5±0.1 ，加入瓊脂，加熱溶化后，分裝，滅菌，冷至60 ℃ ，傾注平皿。

14 ．亞碲酸鹽肉湯培養(yǎng)基

臨用前，取滅菌的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，每100ml 中加人新配制的1 ％亞諦酸鈉（鉀）試液0.2ml ，混勻，即得。

15 ．卵黃氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基

胨                           6.0g

10 ％氯化鈉卵黃液           100ml

牛肉浸出粉                   1.8g

瓊脂                         14.0g

氯化鈉                       30.0g

水                           650ml

除10 %氯化鈉卵黃液外，取上述成分，混合，微溫溶解，調(diào)節(jié)pH 值使滅菌后為7.6 土0 .1 ，滅菌，待冷至約60 ℃ ，以無菌操作加入10 ％氯化鈉卵黃液，充分振搖，傾注平皿。

10 ％氯化鈉卵黃液的制備   取新鮮雞蛋1 個(gè)，以無菌操作取出卵黃，放入10%無菌氯化鈉溶液100ml 中，充分振搖，即得。

16.*氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基

胨                            10.0g

酚磺酞指示液                  2.5ml

牛肉浸出粉                    1.0g

瓊脂                          14.0g

*                        10.0g

水                             l000ml

氯化鈉                         75.0g

除*、酚磺酞指示液及瓊脂外，取上述成分，混合，微溫溶解，調(diào)節(jié)州值使滅菌后為7.4 ±0.2 ，加入瓊脂，加熱溶化后，濾過，分裝，滅菌，冷至60 ℃ ，傾注平皿。

17 ．乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基

胨                              20.0g

乳糖                            10.0g

0.04 ％溴甲酚紫指示液          25ml

水                               l000ml

除0.04 ％溴甲酚紫指示液外，取上述成分，混合，微溫溶解，調(diào)節(jié)pH 值使滅菌后為7.2±0.2 ，加入指示液，分裝于含倒管的小試管中，每管3ml ．滅菌。

18 ．綠膿菌素（Pyocyanin）測定用培養(yǎng)基（PDP瓊脂培養(yǎng)基）

胨                              20.0g

甘油                            l0ml

氯化鎂（無水）                  1.4g

瓊脂                            14.0g

硫酸鉀（無水）                  10.0g

水                              1000ml

取胨、氯化鎂、硫酸鉀和水混合，微溫溶解，調(diào)節(jié)pH 值使滅菌后為7.3±0.1，加入甘油及瓊脂，加熱溶化，混勻，分裝于試管，滅菌，置成斜面。

19.梭菌*

牛肉浸出粉                         10.0g

鹽酸半*                       0.5g

胨                                 10.0g

氯化鈉                             5.0g

酵母浸出粉                         3.0g

醋酸鈉                              3.0g

可溶性淀粉                       1.0g

瓊脂                               0.5g

葡萄糖                              5.0g

水                                 1000ml

取上述成分，混合，加熱煮沸使溶解，調(diào)節(jié)pH 值使滅菌后為6.8士0.2，加熱溶化，濾過，分裝，滅菌。

20.哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基

酪蛋白*消化物                  10.0g

肉胃酶消化物                      5.0g

心*消化物                      3.0g

酵母浸出粉                        5.0g

玉米淀粉                          1.0g

氯化鈉                            5.0g

瓊脂                              15.0g

水                                1000ml

除瓊脂外，取上述成分，混合，微溫溶解，調(diào)節(jié)pH 值使滅菌后為7.3士0.2，加入瓊脂，加熱溶化，濾過，分裝，滅菌，冷至45 ～50 ℃ ，加人相當(dāng)于20mg *的無菌硫酸*，混勻，傾注平皿。

21 ．沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基

胨                       10g

葡萄糖                   40g

水                       1000ml

除葡萄糖外，取上述成分，混合，微溫溶解，濾過。加人葡萄糖，溶解，分裝，滅菌。

22 ．沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基

胨                        10g

水                        1000ml

葡萄糖                      40g

瓊脂                       14g

除瓊脂和葡萄糖外，混合，微溫溶解，濾過。加入瓊脂和葡萄糖，溶解，分裝，滅菌。

23.念珠菌顯色培養(yǎng)基注

胨                      10.2g

瓊脂                    15g

氫罌素                  0.5g

滅菌水                  1000ml

色素                    22.0g

除瓊脂外，取上述成分，混合，微溫溶解，調(diào)節(jié)pH 值至6.3 士0.2 。濾過，加入瓊脂，加熱煮沸，不斷攪拌至瓊脂*溶解，傾注平皿。

24.1％聚山梨酯80-玉米瓊脂培養(yǎng)基

黃色玉米粉                     40g

瓊脂                          10～15g

聚山梨酯80                     10ml

水                            1000ml

取玉米粉、聚山梨酯80及蒸餾水500ml，混合，65℃ 加熱30分鐘，混勻，用紗布濾過，補(bǔ)足原水量。取瓊脂，水500ml，混合，加熱溶解。將以上兩種溶液混合，搖勻，分裝，滅菌。

微生物限度標(biāo)準(zhǔn)

非無菌藥品的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)是基于藥品的給藥途徑及對患者健康潛在的危害而制訂的。藥品的生產(chǎn)、貯存、銷售過程中的檢驗(yàn)，原料及輔料的檢驗(yàn)，新藥標(biāo)準(zhǔn)制訂，進(jìn)口藥品標(biāo)準(zhǔn)復(fù)核，考察藥品質(zhì)量及仲裁等，除另有規(guī)定外，其微生物限度均以本標(biāo)準(zhǔn)為依據(jù)。

1.制劑通則、品種項(xiàng)下要求無菌的制劑及標(biāo)示無菌的制劑   應(yīng)符合無菌檢查法規(guī)定。

2.口服給藥制劑

細(xì)菌數(shù)   每1g不得過l000CFU 。每lml 不得過100CFU 。

霉菌和酵母菌數(shù)   每lg或lml 不得過100CFU 。

大腸埃希菌每1g 或lml不得檢出.

3 ．局部給藥制劑

3.1用于手術(shù)、燒傷及嚴(yán)重創(chuàng)傷的局部給藥制劑   應(yīng)符合無菌檢查法規(guī)定。

3.2 耳、鼻及呼吸道吸入給藥制劑

細(xì)菌數(shù)  每1g、lml 或l0cm² ，不得過100CPU 。

霉菌和酵母菌數(shù)   每1g、lml 或l0cm² ，不得過10CPU 。

*、銅綠假單胞菌    每1g、lml 或l0cm²不得檢出。

大腸埃希菌   鼻及呼吸道給藥的制劑，每1g、lml 或l0cm²，不得檢出。

3.3 陰道、尿道給藥制劑

細(xì)菌數(shù)   每1g、lml 或l0cm²，不得過100CFU 。

霉菌數(shù)和酵母菌數(shù)   每1g、lml 或l0cm² 應(yīng)小于10CFU 。

*、銅綠假單胞菌、白色念珠菌   每1g、lml 或l0cm²，不得檢出。

3 .4 直腸給藥制劑

細(xì)菌數(shù)   每1g不得過l000CFU。每lml 不得過100CFU 。

霉菌和酵母菌數(shù)   每1g 或lml 不得過100CFU 。

*、銅綠假單胞菌   每lg 或lml 不得檢出。

3.5 其他局部給藥制劑

細(xì)菌數(shù)   每1g、lml 或l0cm²不得過100CFU 。

霉菌和酵母菌數(shù)   每1g、lml 或l0cm²不得過100CFU 。

*、銅綠假單胞菌   每1g、lml 或l0cm²不得檢出。

4.含動物組織（包括提取物）的口服給藥制劑   每10g 或10ml 還不得檢出沙門菌。

5.有兼用途徑的制劑   應(yīng)符合各給藥途徑的標(biāo)準(zhǔn)。

6.霉變、長螨者   以不合格論。

7.原料及輔料    參照相應(yīng)制劑的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。

注本檢查法中白色念珠菌檢查所描述該菌在念珠菌顯色培養(yǎng)基上的菌落特征，是指該菌在法國科瑪嘉公司提供的科瑪嘉念珠菌顯色培養(yǎng)基上生長的菌落特征。給出這一信息是為了方便本方法的使用者，并不表示對該公司產(chǎn)品的認(rèn)可．若其他等效產(chǎn)品具有相同的效果，那么也可使用其他等效的產(chǎn)品。