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PCR技術(shù)

時(shí)間:2015-4-14閱讀:245
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PCR: Polymerase chain reaction,即聚合酶鏈反應(yīng)是80年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴(kuò)增技術(shù)。

PCR技術(shù)的發(fā)展歷史


  1985年關(guān)于PCR 的文章由美國科學(xué)家Kary Mullis等人在 《Science》雜志上發(fā)表 。

  1989年《Science》雜志報(bào)道了耐熱性DNA多聚酶 Taq酶(生活在溫泉中的水生嗜熱桿菌內(nèi)提取到的一種耐熱的DNA聚合酶 )的發(fā)現(xiàn),預(yù)示著分子時(shí)代的到來。12月《Science》雜志將PCR和它所使用的聚合酶命名為*個(gè)“年度分子"。


1993年Kary Mullis 因PCR的發(fā)明獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。

PCR技術(shù)的原理 

  遺傳物質(zhì)由細(xì)胞核、染色體、DNA(脫氧核糖核酸和磷酸鏈和堿基構(gòu)成)、堿基(A、T、C、G)是按雙鏈螺旋排列的,堿基序列的長度和排列的順序決定了生物的多樣性。比如人類體細(xì)胞中共有31億個(gè)堿基對,按上述的0.1%的差,人和人之間有3百萬個(gè)堿基對的差別。 

  PCR的基本工作原理就是以擬擴(kuò)增的DNA分子為模板,以一對分別與模板互補(bǔ)的寡核苷酸片段為引物,在DNA聚合酶的作用下,按照半保留復(fù)制的機(jī)理沿著模板鏈延伸直至完成新的DNA合成。

  PCR反應(yīng)的基本成分包括7種基本成分:模板DNA、特異性引物、熱穩(wěn)定DNA聚合酶、脫氧核苷三磷酸(dNTP)、二價(jià)陽離子、緩沖液及一價(jià)陽離子。基本反應(yīng)步驟 :變性--退火--延伸。zui后通過染料如EB染色DNA后在紫外燈下顯色檢出。

PCR技術(shù)的注意事項(xiàng)

1、防止污染,建立良好的質(zhì)量控制。操作時(shí)避免氣溶膠產(chǎn)生,特別注意陽性樣品的拿放,使用一次性耗材,穿戴手套并經(jīng)常更換,永遠(yuǎn)在zui后一步才加核酸,液體分裝使用等。

2、引物設(shè)計(jì)合理。

3、Taq酶擴(kuò)增錯(cuò)誤率較高,大約1/100對堿基/20個(gè)循環(huán)。

4、鎂離子濃度對反應(yīng)效率的影響。

5、儀器穩(wěn)定性,升降溫速率,管子的密合度等。

6、RT-PCR注意防止RNA降解。

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