目的要求

1．了解沉淀反應(yīng)在預(yù)防醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)學(xué)中的意義。

2．初步掌握炭疽沉淀原的制備和環(huán)狀沉淀反應(yīng)，瓊脂擴(kuò)散反應(yīng)的操作方法。

原理  將可溶性抗原與相應(yīng)的抗體混合，在適量電解質(zhì)存在下，經(jīng)過一定時(shí)間，即可形成肉眼可見的沉淀物，稱為沉淀反應(yīng)。參與的抗原稱為沉淀原，抗體稱為沉淀素。

通常都是利用已知抗體檢查未知抗原，以診斷傳染病。但也用于以已知的抗原測(cè)定未知的抗體，以測(cè)定免疫血清的效價(jià)和診斷疫病。

操作步驟

一、環(huán)狀（以炭疽為例）

將含有抗原的透明浸出液重疊于含有抗體的免疫血清上，在兩液交界處發(fā)生環(huán)狀的白色沉淀物，即稱為環(huán)狀。

炭疽環(huán)狀又稱為阿斯可里（Ascoli）氏反應(yīng)。具體操作方法如圖實(shí)9-1所示。

（一）沉淀原的制備

1．熱浸法  取被檢材料（如各種實(shí)質(zhì)臟器、血液、滲出液等）1～3g，在乳缽內(nèi)研碎，然后加5～10倍生理鹽水混合，用移液管吸至試管內(nèi)，置于水浴鍋中煮沸15～30分鐘，用中性石棉過濾，獲得的透明濾液，即為被檢的沉淀原。如果過濾液混濁不透明，可再過濾—次。

2．冷浸法  用以檢查懷疑為炭疽病畜的皮革和獸毛等材料，操作前，先將其高壓滅菌30分鐘，以保證檢查者的安全。然后取被檢材料1g，浸于5～10倍的0.5％石炭酸生理鹽水中，在室溫下或普通冰箱浸泡14～20小時(shí)，用中性石棉過濾，透明的濾液即為沉淀原。

（二）方法與判定

用毛細(xì)吸管吸取少量炭疽沉淀素血清，沿管壁徐徐注入管內(nèi)，通常達(dá)管的1/3高處，再用另一支毛細(xì)吸管吸取制備的沉淀原，沿管壁緩慢注入，使之重疊于炭疽沉淀素血清上面，達(dá)到試管的2/3高處（注意！不要發(fā)生氣泡或搖動(dòng)）。直立靜置，在1～5分鐘內(nèi)，兩液面交界處若出現(xiàn)清晰、整齊的環(huán)狀白輪，則為陽(yáng)性。

為了驗(yàn)證反應(yīng)的正確性，檢驗(yàn)時(shí)可做如下三種對(duì)照試驗(yàn)；

1．炭疽沉淀素血清加標(biāo)準(zhǔn)炭疽沉淀原，應(yīng)為陽(yáng)性；

2．標(biāo)準(zhǔn)炭疽沉淀原加健康馬血清，應(yīng)為陰性；

3．生理鹽水加炭疽沉淀素血清，應(yīng)為陰性。

二、瓊脂擴(kuò)散（以炭疽為例）

抗原、抗體在含有電解質(zhì)的瓊脂凝膠基質(zhì)中可以向四周自由擴(kuò)散，如果二者是相應(yīng)的具有特異性，則在—定部位相遇，并發(fā)生反應(yīng)，出現(xiàn)肉眼可見的白色沉淀線。此種反應(yīng)為瓊脂擴(kuò)散。

由于一種抗原可能含有數(shù)種抗原成分，因而在凝膠中的擴(kuò)散速度也不一樣，所以在凝膠中可以和抗血清形成數(shù)條沉淀線，每一條沉淀線即代表一種抗原成分。所以瓊脂擴(kuò)散反應(yīng)除用作微生物的鑒定、疾病診斷外，還可用作抗原成分的分析。該反應(yīng)的操作方法如下：

（一）瓊脂凝膠的制備

1. 取精制瓊脂干粉1～1.2g，放入100ml含1／萬(wàn)硫柳汞的磷酸緩沖液（PBS）或硼酸緩沖液（BBS）中，水浴加熱融化混勻。

2．融化后以兩層紗布夾薄層脫脂棉過濾，除去不溶性雜質(zhì)。

3．將直徑90mm的潔凈平皿放在平臺(tái)上。每平皿倒入熱的瓊脂15～18毫升，厚度約2.5mm左右。注意不要產(chǎn)生氣泡，冷凝后加蓋，把平皿倒置，防止水分蒸發(fā)，放在普通冰箱中可保存2周左右。

4．將瓊脂平皿放于事先繪制好的圖案上，用打孔器照?qǐng)D案打孔，外周孔徑為6mm，*孔徑為4mm，孔間距3mm，見圖9-2。

（三）加樣與判定

打孔后用瓊脂寫字墨水，在瓊脂板上端寫上日期及編號(hào)等。在*孔加入標(biāo)準(zhǔn)炭疽沉淀原，在外周孔1、2、3、4，各加炭疽沉淀素血清至孔滿為止。待孔中液體吸干后，將平皿倒置以防水分蒸發(fā)；將瓊脂板放入鋪有數(shù)層濕紗布的帶蓋搪瓷盤中，置15～30℃室溫或37℃恒溫箱中，24小時(shí)后，即可出現(xiàn)較粗的白色明顯的沉淀線用瓊脂擴(kuò)散反應(yīng)診斷傳染病，則是往*孔滴加被檢血清1滴（約0.025～0.05ml），在周圍孔滴加不同濃度的抗原各1滴，放濕盒中靜置于室溫下或37℃恒溫箱中2～5天，觀察結(jié)果。若陽(yáng)性反應(yīng)，則在抗原與抗體孔之間出現(xiàn)1～2條或多條白色沉淀線。陰性者，則無白色沉淀線。