一、目的： 
學(xué)習(xí)和掌握從酵母中提制RNA 的原理和方法，從而加深對(duì)核酸性質(zhì)的認(rèn)識(shí)。 
二、原理： 
提取和制備RNA 的首要問(wèn)題是選RNA 含量高的材料。微生物是工業(yè)上大量生產(chǎn)核酸的原料，其中RNA 的提制以酵母zui為理想，因?yàn)榻湍负怂嶂兄饕荝NA（2.67～10.0%），DNA 很少（0.03～0.516％），而且菌體容易收集，RNA 也易于分離。此外，抽提后的菌體蛋白質(zhì)（占干菌體的50%）仍具有很高的應(yīng)用價(jià)值。 
RNA 提制過(guò)程首先要使RNA 從細(xì)胞中釋放，并使它和蛋白質(zhì)分離，然后將菌體除去。再根據(jù)核酸在等電點(diǎn)時(shí)溶解度zui小的性質(zhì)，將pH 調(diào)至2.0～2.5，使RNA 沉淀，進(jìn)行離心收集。然后運(yùn)用RNA 不溶于有機(jī)溶劑乙醇的特性，以乙醇洗滌RNA 沉淀。提取RNA 的方法很多，在工業(yè)生產(chǎn)上常用的是稀堿法和濃鹽法。稀堿法利用細(xì)胞壁在稀堿條件下溶解，使RNA 釋放出來(lái)，這種方法提取時(shí)間短，但RNA 在稀堿條件下不穩(wěn)定，容易被堿分解；濃鹽法是在加熱的條件下，利用高濃度的鹽改變細(xì)胞膜的透性，使RNA 釋放出來(lái)，此法易掌握，產(chǎn)品顏色較好。使用濃鹽法提出RNA 時(shí)應(yīng)注意掌握溫度，避免在20～70℃之間停留時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，因?yàn)檫@是磷酸二酯酶和磷酸單酯酶作用的溫度范圍，會(huì)使RNA 因降解而降低提取率。在90～100℃條件下加熱可使蛋白質(zhì)變性，破壞磷酸二酯酶和磷酸單酯酶，有利于RNA 的提取。 
三、實(shí)驗(yàn)材料、主要 儀器 和試劑 
1．實(shí)驗(yàn)材料 
活性*；pH0.5～5.0 的精密試紙；冰塊。 
2． 儀器 
（1）藥物天平 
（2）三角瓶（100mL） 
（3）量筒（50mL） 
（4）水浴鍋 
（5）電爐 
（6）試管木夾 
（7）離心管 
（8）離心機(jī)（4 000r/min） 
（9）燒杯（250mL, 50mL, 10mL） 
（10）滴管及玻棒 
（11）吸濾瓶（500mL） 
（12）布氏漏斗（60mm） 
（13）表面皿（8cm） 
（14）烘箱 
（15）干燥器 
（16）紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 
3． 試劑 
（1）NaCl（化學(xué)純） 
（2）6mol/L HCl 
（3）95％乙醇（化學(xué)純） 
四、操作步驟 
1．提取 
活性*粉5g，倒入100mL 三角瓶中，加NaCl 5g，水50mL，攪拌均勻，置于沸水浴中提取1h。 
2．分離 
將上述提取液取出，立即用自來(lái)水冷卻，裝入大 離心管 內(nèi)，以3 500r/min 離心10min，使提取液與菌體殘?jiān)确蛛x。 
3．沉淀RNA 
將離心得到的上清液傾于50mL 燒杯中，并置于放有冰塊的250mL 燒杯中冷卻，待冷至10℃以下時(shí)，用6mol/L HCl 小心地調(diào)節(jié)pH 至2.0～2.5。隨著pH 下降，溶液中白色沉淀逐漸增加，到等電點(diǎn)時(shí)沉淀量zui多（注意嚴(yán)格控制pH）。調(diào)好后繼續(xù)于冰水中靜置10min，使沉淀充分，顆粒變大。 
4．抽濾和洗滌 
上述懸浮液以3 000r/min 離心10min，得到RNA 沉淀。將沉淀物放在10mL 小燒杯內(nèi)，用95％的乙醇5～10mL 充分?jǐn)嚢柘礈?，然后在鋪有已稱重濾紙的布氏漏斗上用 真空泵 抽氣過(guò)濾，再用95％乙醇5～10mL 淋洗3 次。由于RNA 不溶于乙醇，洗滌不僅可脫水，使沉淀物疏松，便于過(guò)濾、干燥，而且可除去可溶性的脂類及色素等雜質(zhì)，提高了制品的純度。 
5．干燥 
從布氏漏斗上取下有沉淀物的濾紙，放在8cm 表面皿上，置于80℃烘箱內(nèi)干燥。將干燥后的RNA 制品稱重。 
6．含量測(cè)定 
稱取一定量干燥后的RNA 產(chǎn)品配制成濃度為10～50μg/mL 的溶液，在751 型 分光光度計(jì) 上測(cè)定其260nm 處的光密度值，按下式計(jì)算RNA 含量： 
 
式中：OD260nm 為260nm 處的光密度值；L 為比色杯的光徑（cm）；0.024 為1mL 溶液含有1μg RNA 的光密度值。 
五、結(jié)果計(jì)算 
根據(jù)含量測(cè)定的結(jié)果按下式計(jì)算提取率： 
 
六、思考題 
1．RNA 提制中注意事項(xiàng)是什么？ 
參考答案 
1．主要注意事項(xiàng)為：避開(kāi) 核酸酶 作用的溫度范圍20～70℃，防止RNA 降解。同時(shí)在調(diào)pH 值時(shí)，一定要緩慢小心，且要在低溫下進(jìn)行。此外，在抽濾洗滌時(shí)，要用乙醇洗滌，且不可用水洗，否則將導(dǎo)致RNA 部分溶解而造成損失，降低RNA 提取率。