分析轉(zhuǎn)化的功能和表達需要DNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至宿主細胞染色體。外源基因進入細胞后，部分能夠通過細胞質(zhì)進入細胞核 內(nèi)，根據(jù)細胞類型，至多80%的進入核內(nèi)的外源DNA得到瞬時表達。極少數(shù)情況下，進入細胞的外源DNA通過系列非同源性分子間重組核連接，形成巨大的***結(jié)構(gòu)zui終整合進細胞染色體。細胞基因組自由部分表達，所以整合并不一定意味著表達，只有整合到表達區(qū)的基因才會表達，而且整合到不同的染色體區(qū)段的外源基因的表達的量也是不同的。由于攝取、整合、表達外源基因是小概率事件，通常根據(jù)新表型篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染體。一般情況下這種新表型由共轉(zhuǎn)染的編碼抗生素抗性基因提供。細菌Tn5轉(zhuǎn)座子序列(neo抗性基因)攜帶的氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶可以將G418轉(zhuǎn)變成無毒形式。G418是一種氨基糖類抗生素，其結(jié)構(gòu)與*、*、*相似，它通過影響80S核糖體功能而阻斷蛋白質(zhì)合成，對原核和真核等細胞都有毒性，包括細菌、酵母、植物和哺乳動物細胞，也包括原生動物和蠕蟲。是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染zui常用的選擇試劑。當(dāng)neo基因被整合進真核細胞基因組合適的地方后，則能啟動neo基因編碼的序列轉(zhuǎn)錄為mRNA，從而獲得抗性產(chǎn)物氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶的表達，使細胞獲得抗性而能在含有G418的選擇性培養(yǎng)基中生長。G418的這一選擇特性，已在基因轉(zhuǎn)移、基因敲除、抗性篩選以及轉(zhuǎn)基因動物等方面得以廣泛應(yīng)用。

在進行轉(zhuǎn)染時細胞膜 受到影響，抗生素可能對細胞產(chǎn)生較大影響，加上G418有殺菌作用，所以有人主張轉(zhuǎn)讓時不加其它抗生素。其實G418本身有很好的殺菌效果，在用G418進行篩選的過程中很少會發(fā)生污染。但有一點，其實我覺得問題也不是很大，那就是：在老外的一本實驗手冊中提到，在脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染時所用培養(yǎng)基中不加任何抗生素。我想他的想法可能是脂質(zhì)體對細胞膜有影響，可能此時加抗生素對細胞損傷較大。因為*、*、G418均是氨基糖甙類藥物，其藥理作用*一樣。所以沒有必要再用，而且由于另外抗生素的添加實際增加氨基糖甙類藥物的濃度，劑量有誤差，不利于各實驗室之間的交流，在實際操作中，培養(yǎng)液中有抗生素對細胞培養(yǎng)與篩選影響不大。

Protocol

1.G418的配制： 取1g G418溶于1ml 1M的HEPES液中，加蒸餾水至10ml，過濾消毒，4度保存。

2.細胞培養(yǎng) ：取待測培養(yǎng)細胞，制備成細胞懸液，按等量接種入多孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)6小時左右開始加藥。

3.制備篩選培養(yǎng)基：在100μg/ml～1000μg/ml范圍內(nèi)確定幾個梯度，比如先做個100μg/ml、400μg/ml、800μg/ml、1000μg/ml，按梯度濃度用培養(yǎng)基稀釋G418制成篩選培養(yǎng)基。

4.加G418篩選： 吸除培養(yǎng)孔中培養(yǎng)基，PBS洗滌一次，每孔中加入不同濃度的篩選培養(yǎng)基。

5.換液：根據(jù)培養(yǎng)基的顏色和細胞生長情況，每3~5天更換一次篩選培養(yǎng)基。方法同4。

6.確定*篩選濃度：在篩選10～14天內(nèi)能夠殺死所有細胞的zui小G418濃度即為*篩選濃度。在*輪就篩選出*G418濃度的可能性不大，zui有可能的是出現(xiàn)這種情況：用某一濃度G418的量在篩選14天后還不能殺死細胞，而用下一個梯度的G418的量在10天前就看不到活細胞了。假如是400μg/ml不能殺死細胞，而800μg/ml在第5天就把所有細胞都殺死了，則可以再用500μg/ml、600μg/ml、700μg/ml進一步篩選，以確定*篩選濃度!心得：由于特性明確的細胞系G418的*用量還是比較穩(wěn)定的，所以有時候不需要在這么大范圍內(nèi)進行篩選。比如說你要轉(zhuǎn)染NIH3T3細胞，現(xiàn)在我告訴你我測試過NIH3T3細胞對G418的敏感性，我用的篩選濃度是200μg/ml。這時你就可以做150μg/ml、200μg/ml、300μg/ml三個濃度進行篩選