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酵母總RNA提取方法

時(shí)間:2014-8-14閱讀:400
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問: 請問大家提取酵母的總RNA都用什么方法?有好用的試劑盒嗎?酵母總RNA提取應(yīng)該注意什么?

答:使用熱酚法抽提酵母RNA,很好用,至今沒有失敗過。

(1)  將酵母細(xì)胞培養(yǎng)在3ml選擇性培養(yǎng)基中,30℃過夜旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)。

(2)  稀釋過夜培養(yǎng)的菌液,重新在10ml培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。

(3)  OD600達(dá)到1.0時(shí),收菌,4000rpm/min離心5min,棄培養(yǎng)基。

(4)  將細(xì)胞懸浮于400μl AE緩沖液(50mM Sodium Acetate,10mM EDTA 調(diào)整pH值至5.2)。

(5)  加入1/10體積的10% SDS,充分混合。 

(6)  加入等體積在65℃預(yù)熱的酸性酚(pH4.5),混合。

(7)  65℃加熱5min,冰上放置10min。

(8)  在室溫下8000rpm/min離心10min。

(9)  取水相,加入等體積的酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1),10000rpm/min離心8min。

(10)  取水相,加入等體積氯仿/異戊醇(49∶1)10000rpm/min離心8min。

(11)  加入1/10體積3M pH5.2的醋酸鈉,2.5倍體積的純乙醇,-20℃過夜沉淀。

(12)  沉淀樣品于4℃離心5min,去除液體。

(13)  在冰上干燥RNA(放置15min),zui后用適量DEPC水溶解RNA。 

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