(一)*向等電聚焦

1.從冰箱中取-20℃冷凍保存的水化上樣緩沖液(I)(不含DTT，不含Bio-Lyte)一小管(1ml/管)，置室溫溶解。

2.在小管中加入0.01g DTT，Bio-Lyte 4-6、5-7各2.5ml，充分混勻。

3.從小管中取出400ml水化上樣緩沖液，加入100ml樣品，充分混勻。

4.從冰箱中取-20℃冷凍保存的IPG預(yù)制膠條(17cm pH 4-7)，室溫中放置10分鐘。

5.沿著聚焦盤或水化盤中槽的邊緣至左而右線性加入樣品。在槽兩端各1cm左右不要加樣，中間的樣品液一定要連貫。注意：不要產(chǎn)生氣泡。否則影響到膠條中蛋白質(zhì)的分布。

6.當(dāng)所有的蛋白質(zhì)樣品都已經(jīng)加入到聚焦盤或水化盤中后，用鑷子輕輕的去除預(yù)制IPG膠條上的保護(hù)層。

7.分清膠條的正負(fù)極，輕輕地將IPG膠條膠面朝下置于聚焦盤或水化盤中樣品溶液上，使得膠條的正極(標(biāo)有+)對(duì)應(yīng)于聚焦盤的正極。確保膠條與電極緊密接觸。不要使樣品溶液弄到膠條背面的塑料支撐膜上，因?yàn)檫@些溶液不會(huì)被膠條吸收。同樣還要注意不使膠條下面的溶液產(chǎn)生氣泡。如果已經(jīng)產(chǎn)生氣泡，用鑷子輕輕地提起膠條的一端，上下移動(dòng)膠條，直到氣泡被趕到膠條以外。

8.在每根膠條上覆蓋2-3ml礦物油，防止膠條水化過(guò)程中液體的蒸發(fā)。需緩慢的加入礦物油，沿著膠條，使礦物油一滴一滴慢慢加在塑料支撐膜上。

9.對(duì)好正、負(fù)極，蓋上蓋子。設(shè)置等電聚焦程序。

10.聚焦結(jié)束的膠條。立即進(jìn)行平衡、第二向SDS-PAGE電泳 ，否則將膠條置于樣品水化盤中，-20℃冰箱保存。

(二)第二向SDS-PAGE電泳

1.配制10%的丙烯酰胺凝膠兩塊。配80ml凝膠溶液，每塊凝膠40ml，將溶液分別注入玻璃板夾層中，上部留1cm的空間，用MilliQ水、乙醇或水飽和正丁醇封面 ，保持膠面平整。聚合30分鐘。一般凝膠與上方液體分層后，表明凝膠已基本聚合。

2.待凝膠凝固后，倒去分離膠表面的MilliQ水、乙醇或水飽和正丁醇，用MilliQ水沖洗。

3.從-20℃冰箱中取出的膠條，先于室溫放置10分鐘，使其溶解。

4.配制膠條平衡緩沖液I。

5.在桌上先放置干的厚濾紙，聚焦好的膠條膠面朝上放在干的厚濾紙上。將另一份厚濾紙用MilliQ水浸濕，擠去多余水分，然后直接置于膠條上，輕輕吸干膠條上的礦物油及多余樣品。這可以減少凝膠染色時(shí)出現(xiàn)的縱條紋。

6.將膠條轉(zhuǎn)移至溶漲盤中，每個(gè)槽一根膠條，在有膠條的槽中加入5ml膠條平衡緩沖液I。將樣品水化盤放在水平搖床上緩慢搖晃15分鐘。

7.配制膠條平衡緩沖液II。

8.*次平衡結(jié)束后，*倒掉或吸掉樣品水化盤中的膠條平衡緩沖液I。并用濾紙吸取多余的平衡液(將膠條豎在濾紙上，以免損失蛋白或損壞凝膠表面)。再加入膠條平衡緩沖液II，繼續(xù)在水平搖床上緩慢搖晃15分鐘。

9.用濾紙吸去SDS-PAGE聚丙烯酰胺 凝膠上方玻璃板間多余的液體。將處理好的第二向凝膠放在桌面上，長(zhǎng)玻璃板在下，短玻璃板朝上，凝膠的頂慷宰拋約骸?br>

10.將瓊脂 糖封膠液進(jìn)行加熱溶解。

11.將10×電泳緩沖液，用量筒稀釋10倍，成1×電泳緩沖液。趕去緩沖液表面的氣泡。

12.第二次平衡結(jié)束后，*倒掉或吸掉樣品水化盤中的膠條平衡緩沖液II。并用濾紙吸取多余的平衡液(將膠條豎在濾紙上，以免損失蛋白或損壞凝膠表面)。

13.將IPG膠條從樣品水化盤中移出，用鑷子夾住膠條的一端使膠面*浸末在1×電泳緩沖液中。然后將膠條膠面朝上放在凝膠的長(zhǎng)玻璃板上。其余膠條同樣操作。

14.將放有膠條的SDS-PAGE凝膠轉(zhuǎn)移到灌膠架上，短玻璃板一面對(duì)著自己。在凝膠的上方加入低熔點(diǎn)瓊脂糖封膠液。

15.用鑷子、*或是平頭的針頭，輕輕地將膠條向下推，使之與聚丙烯酰胺凝膠膠面*接觸。注意不要在膠條下方產(chǎn)生任何氣泡。在用鑷子、*或平頭針頭推膠條時(shí)，要注意是推動(dòng)凝膠背面的支撐膜，不要碰到膠面。

16.放置5分鐘，使低熔點(diǎn)瓊脂糖封膠液*凝固。

17.在低熔點(diǎn)瓊脂糖封膠液*凝固后。將凝膠轉(zhuǎn)移至電泳槽中。

18.在電泳槽加入電泳緩沖液后，接通電源，起始時(shí)用的低電流(5mA/gel/17cm)或低電壓，待樣品在*走出IPG膠條，濃縮成一條線后，再加大電流(或電壓)(20-30mA/gel/17cm)，待溴酚藍(lán)指示劑達(dá)到底部邊緣時(shí)即可停止電泳。

19.電泳結(jié)束后，輕輕撬開兩層玻璃，取出凝膠，并切角以作記號(hào)(戴手套，防止污染膠面)。

20.進(jìn)行染色。