流式細胞儀(FCM)是八十年代集單克隆抗體、熒光化學(xué)、激光、計算機等高技術(shù)發(fā)展起來的一種*儀器，已廣泛應(yīng)用于免疫學(xué)、生物化學(xué)、生物學(xué)、腫瘤學(xué)以及血液學(xué)等方面的研究和臨床常規(guī)工作。其中檢測人白細胞表面標(biāo)志可對白血病、淋巴瘤作用迅速正確的診斷，對淋巴細胞群和亞群進行分類，還能分離純化某一群或亞群細胞。

活細胞免疫熒光技術(shù)是用于FCM檢測的標(biāo)本準(zhǔn)備，染色后也能在熒光顯微鏡下進行觀察，在某些實驗條件下，活細胞免疫熒光染色后的特異性和敏感性要優(yōu)于滴片固定的常規(guī)間接免疫熒光的結(jié)果。
 

(一)　原理

活細胞表面保留有較完整的抗原或受體，先用特異性鼠源性單克隆抗體與細胞表面相應(yīng)抗原結(jié)合，再用熒光標(biāo)記的第二抗體結(jié)合，根據(jù)所測定的熒光強度和陽性百分率即可知相應(yīng)抗原的密度和分布。
 

(二)　操作步驟

制備活性高的細胞懸液(培養(yǎng)細胞系、外周血單個核細胞、胸腺細胞、脾細胞等均可用于本法)

↓

用10％FCS　RPMI1640調(diào)整細胞濃度為5×10⁶～1×10⁷／ml

↓

取40μl細胞懸液加入預(yù)先有特異性McAb(5～50μl)的小玻璃管或塑料離心管，再加50μl 1∶20(用DPBS

稀釋)滅活正常兔血清

                    ↓4℃ 30min

用洗滌液洗滌2次，每次加洗滌液2ml左右1000rpm×5min

↓

棄上清，加入50μl工作濃度的羊抗鼠(或兔抗鼠)熒光標(biāo)記物，充分振搖

                       ↓　4℃ 30min

用洗滌液洗滌2次，每次加液2ml左右1000rpm×5min

↓

加適量固定液(如為FCM制備標(biāo)本，一般加入1ml固定液，如制片后在熒光顯微鏡下觀察，

視細胞濃度加入100～500μl固定液)

↓

FCM檢測或制片后熒光顯微鏡下觀察(標(biāo)本在試管中可保存5～7天)

(三)　試劑和器材

1.　各種特異性單克隆抗體。

2.　熒光標(biāo)記的羊抗鼠或兔抗鼠第二抗體，滅活正常兔血清。

3.　10％ FCS RPMI1640, DPBS、洗滌液、固定液(見附錄)。

4.　玻璃管、塑料管、離心機、熒光顯微鏡等。
 

(四)　注意事項

1.　整個操作在4℃下進行，洗滌液中加有比常規(guī)防腐劑量高10倍的NaN３，上述實驗條件是防止一抗結(jié)合細胞膜抗原后發(fā)生交聯(lián)、脫落。

2.　洗滌要充分，以避免游離抗體封閉二抗與細胞膜上一抗相結(jié)合，出現(xiàn)假陰性。

3.　加適量正常兔血清可封閉某些細胞表面免疫球蛋白Fc受體，降低和防止非特異性染色。

4.　細胞活性要好，否則易發(fā)生非特異性熒光染色。
 

附:

1. DPBS (×10, 貯存液)

NaCl 80g

KCl 2g 　　　　　蒸餾水加至1000ml

Na₂HPO₄ 11.5g  臨用時用蒸餾水1∶10稀釋

KH₂PO₄ 2g
 

2.　洗滌液

DPBS　　　　　　900ml

FCS 50ml (終濃度　5％)

4％NaN₃50ml (終濃度0.2％)
 

3.　固定液

DPBS　　　　1000ml

葡萄糖　　　　20g (終濃度2％)

甲　醛　　　　10ml

NaN₃　　　0.2g (終濃度0.02％)