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檢查試管是否干燥、潔凈，若否，則將其洗凈并置于干燥箱內(nèi)120℃烘干。
1.標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作
取普通清潔試管7支，標(biāo)號(hào)，1號(hào)管為空白，2～7管用微量注射器分別加1.0mg/mL的牛血清白蛋白（即標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)）溶液10，20，40，60，80，100mL。各管均用0.015mol/L PBS緩沖液補(bǔ)充到100mL（即0.1mL），詳見(jiàn)表6-1?；靹虼?。
表13-1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作
管號(hào) | 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)（mL） | 緩沖液（mL） | 總體積（mL） |
1 | 0 | 100 | 100 |
2 | 10 | 90 | 100 |
3 | 20 | 80 | 100 |
4 | 40 | 60 | 100 |
5 | 60 | 40 | 100 |
6 | 80 | 20 | 100 |
7 | 100 | 0 | 100 |
2.將待測(cè)蛋白配成合適濃度
另取3支清潔試管，編號(hào)8、9、10，用微量注射器按表6-2操作，將待測(cè)蛋白配成系列濃度。
表13-2待測(cè)蛋白的稀釋
管號(hào) | 待測(cè)蛋白質(zhì)（mL） | 緩沖液（mL） | 總體積（mL） | 稀釋倍數(shù) |
8 | 20 | 80 | 100 | 5 |
9 | 40 | 60 | 100 | 2.5 |
10 | 60 | 40 | 100 | 1.67 |
3.加入G250試劑
各試管充分混勻后，用取樣器分別加入5.0mL考馬斯亮蘭G250試劑，每加完一管，立即混合（注意不要太劇烈，以免產(chǎn)生大量氣泡而難于消除）。
4.比色
各管室溫靜置2～5min后，在分光光度計(jì)上測(cè)定595nm處的光吸收值A 595 ，空白對(duì)照為第1號(hào)試管，標(biāo)準(zhǔn)和待測(cè)蛋白樣同時(shí)比色。
注意：不可使用石英比色皿（因不易洗去染色），只能使用玻璃比色皿，使用后立即用少量95%的乙醇潤(rùn)洗，洗去顏色。
5.制作標(biāo)準(zhǔn)曲線
以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)濃度（mg/mL）為橫座標(biāo)、吸光度值A 595 為縱座標(biāo)作圖，即得到一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。
6.根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測(cè)蛋白濃度
在標(biāo)準(zhǔn)曲線上，根據(jù)測(cè)出的待測(cè)樣品的A 595 值，查出試管中蛋白質(zhì)濃度，再按照計(jì)算公式：
待測(cè)蛋白質(zhì)的濃度（mg/mL）＝查出的濃度×稀釋倍數(shù) |
計(jì)算出待測(cè)蛋白濃度。如樣品稀釋合理且操作得當(dāng)，待測(cè)蛋白的三個(gè)數(shù)值應(yīng)具有同一性，取其平均值作為待測(cè)蛋白濃度。如某一光吸收值落在標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍外，舍棄該點(diǎn)。
計(jì)算
管號(hào) | 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)（mL ） | 緩沖液（mL ） | G-250試劑（mL） | 每管中的蛋白質(zhì)濃度（mg/mL） | 光吸收值（A 595 ） | |
標(biāo) 準(zhǔn) 蛋 白 | 1 | 0 | 100 | 5 | 0 |
|
2 | 10 | 90 | 5 | 0.1 |
| |
3 | 20 | 80 | 5 | 0.2 |
| |
4 | 40 | 60 | 5 | 0.4 |
| |
5 | 60 | 40 | 5 | 0.6 |
| |
6 | 80 | 20 | 5 | 0.8 |
| |
7 | 100 | 0 | 5 | 1.0 |
| |
管號(hào) | 待測(cè)蛋白質(zhì)（mL ） | 緩沖液（mL ） | G250試劑（mL） | A 595 | 查出的濃度（mg/mL） | 稀釋倍數(shù) | 待測(cè)蛋白質(zhì)濃度（mg/mL） | ||
待測(cè)蛋白 | 8 | 20 | 80 | 5 |
|
| 5 |
| |
9 | 40 | 60 | 5 |
|
| 2.5 |
| ||
10 | 60 | 40 | 5 |
|
| 1.67 |
| ||
結(jié)果：待測(cè)蛋白質(zhì)的濃度為： mg/mL
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